甲状腺激素受体beta亚型不保守的DBD与抗肿瘤作用

Novelly discovered thyroid hormone receptor β isoform - TRβΔ is highly homological with TRβ1, merely 36 amino acid residues longer than the latter. Structural analysis shows that this additional 36 amino acids happened to insert into the DNA binding domain of TRβ1 and changed the highly conserved DBD region in the nuclear receptor family. TRβ1 has been confirmed with tumor suppressor function, and many tumorigenesis is correlated with TRβ1 down-regulation. When comparison the expression of TRβΔ and TRβ1, we found that the absolute subject is TRβΔ in normal rat tissue，and the significant down-regulation in tumor tissue is also TRβΔ instead of TRβ1. In consideration of the detection of rats TRβ1 had failed to distinguish between TRβΔ and TRβ1, so previous studies found that the down-regulation of TRβ1 in many tumor tissue of rat is real mainly TRβΔ. This suggests that the tumor suppression function of TRβΔ is more significant than TRβ1. Hence, in this study, primarily focus on the anti-tumor differences between TRβΔ and TRβ1 and its relationship with the changes of DBD structure, to clarify the effects of TRβ DBD structure changes on its anti-tumor; Secondly, these additional 36 amino acids in the DBD of TRβΔ were introduced into the corresponding segment of human TRβ1, then detect the anti-tumor effects of the human derived TRβΔ, and this will provide new candidate gene for gene therapy of tumor.

大鼠体内发现的甲状腺激素受体β新亚型-TRβΔ，较与其高度同源的TRβ1仅在DNA结合区（DNA-binding domain, DBD）多出了36个氨基酸残基。TRβ1已被证实具有抑癌功能，多种肿瘤的发生均与TRβ1表达下调相关。而我们在比较TRβΔ与TRβ1的表达时发现，正常大鼠组织中以TRβΔ的表达为绝对主体，在肿瘤组织中下调极为显著的也是TRβΔ而非TRβ1。鉴于此前对大鼠体内TRβ1的检测未能区分TRβΔ与TRβ1，所报道的肿瘤组织中下调的TRβ1实际主要为TRβΔ。这提示TRβΔ可能较TRβ1的抑癌功能更为显著。为此，拟通过研究TRβΔ与TRβ1的抗肿瘤差异以及这种差异是否与DBD结构的改变相关，阐明TRβ DBD结构改变对其抗肿瘤作用的影响；其次将TRβΔ DBD中特有的36个氨基酸残基引入人TRβ1相应区段，并检测人源性TRβΔ抗肿瘤作用，为肿瘤的基因治疗提供新的备选基因。

甲状腺激素受体(thyroid hormone receptors, TRs)除具有代谢调节作用外，越来越多的研究证实其还具有调节肿瘤发生的作用，尤其是TRβ受体亚型表现出了明显的抑瘤功能。在TRβ1基因缺失的肿瘤细胞中重新转染TRβ1基因可有效抑制肿瘤细胞的生长及转移。鉴于大鼠体内发现的新受体TRβΔ与TRβ1高度同源，唯一区别是在其DBD多出了36个氨基酸残基。因此需要对TRβΔ与TRβ1的抗肿瘤功能进行分开研究，以阐明新受体TRβΔ与TRβ1在抗肿瘤作用上的异同，以及这种差异是否与两者DBD结构改变有关。由于目前在人体正常及肿瘤组织中均未检测到类似的人源性TRβΔ，因此我们设想能否对人TRβ1的DBD进行改造，构建人源性TRβΔ，发挥其抑瘤功能。. 体外细胞实验结果显示，TRβΔ与TRβ1对肿瘤相关靶基因在选择和作用强度上存在差异，导致二者对多种肿瘤细胞的作用及其机制存在差异。将筛选出的选择性调控靶基因的甲状腺激素反应元件（TREs）的碱基序列，引入荧光素酶报告基因表达载体，构建由TREs驱动报告基因表达的载体pGL3-p/TREs。然后pGL3-p/TREs分别与TRβΔ或TRβ1共转染，通过萤光素酶活性检测进一步验证了TRβΔ与TRβ1对靶基因的选择性作用。改变TRβΔ“P-box”中第三位氨基酸及DBD内两锌指间距离，萤光素酶活性检测结果显示，DBD区两锌指间距离的改变影响了TRβΔ对靶基因的选择性作用。将大鼠TrβΔ中多出的新外显子序列（108bp），引入野生型人TRβ1(wild-type human TRβ1, wt-hTRβ1) DBD中相应位置，成功构建人源性TRβΔ即修饰型TRβ1 (Modified Human TRβ1，m-hTRβ1)。体内、外实验结果均显示m-hTRβ1在TRβ1表达缺失的肿瘤细胞中具有明显的抑瘤作用且优于wt-hTRβ1。. 本课题初步明确TRβ亚型（TRβΔ与TRβ1）相对不保守DBD在抗肿瘤中的作用及其机制，增加和完善了对现有TRβ的认识；在此基础上构建的m-hTRβ1，体内、外研究均显示其具有抑瘤作用，为今后肿瘤的预防和分子靶基因治疗提供了新的思路和分子靶标;本课题是对我们前期发现的甲状腺激素受体新同功体TRβΔ的继续和深入研究，具有重要自主创新意义。