泛素在HPV持续感染时对TLR功能的作用机制研究

人类乳头瘤病毒（HPV）造成的持续感染和细胞恶性转化与机体免疫反应密切相关但机制至今不明。Toll样受体(TLR)在天然免疫中至关重要，而泛素是TLR介导的宿主免疫反应关键调节因素之一。基于课题组对HPV感染的多年研究，本项目拟在建立HPV感染的原代人鳞状上皮细胞株的基础上，通过研究尖锐湿疣主要感染的HPV 6b、11型和亚洲地区宫颈癌高发的HPV58型的主要致病基因E6/E7蛋白对TLR的表达、信号通路及其功能的影响来研究HPV与TLR的相互作用；通过研究HPV感染细胞内泛素对TLR信号通路及其功能的影响来研究HPV对泛素系统的作用，以期进一步揭示HPV感染对泛素-蛋白酶体途径及泛素信号传导通路、宿主抗病毒免疫反应的影响及作用机制。研究结果将丰富HPV致病的分子免疫学机制的研究，并有利于HPV感染的防治策略研究。具有较深远的学术意义和社会意义。

目的 研究低危型HPV感染机制对有效控制尖锐湿疣(CA)具有重要意义。本课题研究低危型HPV病毒E7蛋白对朗格汉斯细胞(LC) TLR信号通路的调控作用，并分析泛素系统在其中的作用。方法 诱导人外周血单核细胞分化为LC，以HPV6b E7及各TLR激动剂刺激48h，PCR、流式细胞仪、WB检测TLR的表达，WB检测TLR信号通路分子的表达及磷酸化水平。继而以表达HPV6b / 11E6或E7基因的质粒转染HEK293细胞，或以小鼠DC2.4细胞负载HPV6b / 11 E7蛋白，再给予TLR激动剂刺激48h后收获细胞，WB检测泛素及泛素酶的表达。 结果 (1) HPV 6b E7蛋白刺激后LC细胞TLR3、4、10基因表达下调，TLR9基因表达明显上调，TLR3/7/8/9蛋白的表达则无明显改变； (2) LC经HPV 6b /11 E7蛋白刺激后，IRAK1蛋白表达显著下调， TLR激动剂刺激不能逆转其下调。HPV E7蛋白刺激或HPV E7蛋白联合TLR激动剂刺激细胞TRAF6、MyD88、IRAK4、IRF3、IRF7蛋白表达及IRAK4、IRF3、IRF7蛋白磷酸化水平无明显统计学差异。PCR结果则提示单纯HPVE7蛋白组IRAK1基因mRNA的表达略低于空白对照组。 (3)、HPV6b型和11型的E6基因能上调HEK293细胞泛素表达，E6和E7基因均能上调UB1a/b和UBE2N，而E7基因下调UBCH5C的表达。HPV6b / 11E7蛋白刺激均不影响小鼠DC2.4细胞泛素表达， 多数TLR激动剂对其泛素表达无影响，而BCG刺激可导致泛素明显下降，并且与 UBE1a/b、UbcH5C 和UBE2N的表达一致。UBE2L3表达均无明显变化。结论 (1)低危型HPV E7蛋白改变LC细胞TLR基因的表达，而TLR蛋白表达无明显改变，其中可能涉及泛素及泛素酶的作用；(2) 低危型HPV E7蛋白可通过干扰IRAK1蛋白分子的表达干扰TLR信号通路，部分通过IRAK1基因的下调； (3)与E7蛋白相比，细胞泛素化机制对E6蛋白的反应更为明显，低危型HPVE7蛋白对细胞泛素化的调控可能更依赖于泛素结合酶E2。