姜黄素调控CA916798蛋白磷酸化逆转肺癌顺铂耐药机制研究

姜黄素广谱抗癌作用及低毒性已得到国际公认，并成为美国国立卫生院开展临床Ⅰ期研究热点。肺癌MDR是治疗中急需解决难题，寻找低毒有效MDR逆转剂迫在眉睫。前期研究证实姜黄素逆转肺腺癌MDR细胞A549/CDDP对顺铂耐药，但机制不清，抑制PI3K/AKT通路或CA916798蛋白均逆转A549/CDDP对顺铂耐药，CA916798蛋白是P-AKT作用底物，姜黄素抑制AKT磷酸化。因此推测，姜黄素可能通过PI3K/AKT调控CA916798蛋白磷酸化逆转顺铂耐药。本项目拟检测姜黄素对CA916798磷酸化影响并鉴定其具体磷酸化位点；探讨去除CA916798磷酸化位点及持续磷酸化该位点对CA916798功能影响及姜黄素对其调节作用；另外，建立裸鼠移植瘤模型并予姜黄素治疗，体内观察对其磷酸化调控作用及药敏影响。旨从正反两方面探讨姜黄素对CA916798蛋白调控机制，为靶向阻遏肺癌MDR提供分子靶标。

肺癌MDR是治疗中急需解决难题，寻找低毒有效MDR逆转剂迫在眉睫，CA916798基因是采用抑制消减杂交（SSH）技术从人肺腺癌 MDR细胞系SPC-A-1/CDDP中克隆表达的新基因。我们已经证实该基因为一条新的顺铂耐药相关的新基因。本项目首先验证A549/CDDP细胞系多药耐药性，成功建立了持续AKT1增强表达、持续AKT1抑制表达的细胞系，AKT1增强表达后CA916798基因表达增加，AKT1抑制表达后CA916798基因表达下降；定量PCR及western bolt结果表明姜黄素III能有效抑制A549/CDDP细胞中CA916798 mRNA与蛋白表达，并能逆转其多药耐药性；免疫共沉淀、免疫双荧光方法检测结果显示，耐顺铂的肺腺癌A549/CDDP细胞CA916798、P-AKT1表达均显著强于其亲代A549细胞，两者表达均主要位于细胞浆中，且具有共同分布趋势。CA916798和p-AKT1 在A549、A549/CDDP细胞中均存在结合，这种结合在A549/CDDP细胞显著强于其亲代A549细胞，姜黄素III作用后这种结合被抑制；抑制P-AKT1（AKT1-K179M、LY294002）均显著抑制A549、A549/CDDP细胞CA916798 mRNA及蛋白水平的表达。而抑制CA916798对A549、A549/CDDP细胞PI3K/AKT通路主要成员mRNA及蛋白水平无显著影响。姜黄素III作用后能够抑制 p-AKT、p-mTOR、CA916798的表达；而下调 CA916798 的表达并不影响p-AKT的表达。表明PI3K/AKT通路位于CA916798的上游，姜黄素III通过PI3K/AKT调控CA916798进而逆转耐药；我们进一步制备了5种CA916798磷酸化位点突变体，结果表CA916798-S20A突变体稳定转染后A549/CDDP细胞耐药性降低，化疗药物敏感性升高；CA916798-S20D突变体稳定转染A549/CDDP细胞后能模拟持续磷酸化状态，细胞耐药性增强，化疗药物敏感性下降；建立持续磷酸化和持续去磷酸化裸鼠移植瘤模型，姜黄素III治疗后持续去磷酸化组裸鼠移植瘤明显缩小，CA916798蛋白表达下降，而持续磷酸化组裸鼠移植瘤增大明显，CA916798蛋白表达增强。