新的胃癌MDR相关分子编码基因的克隆鉴定及功能研究

多药耐药（MDR）是胃癌化疗失败的主要原因，MDR的逆转有赖于发现参与MDR的关键分子并阐明其耐药机理。目前虽然已经发现一些MDR相关分子，但仍不能完全解释胃癌MDR现象。前期工作中，我们通过噬菌体肽库筛选得到能够特异结合于胃癌耐药细胞的短肽GMBP1（正在申请专利），其结合受体在MDR细胞高表达提示它可能与胃癌MDR密切相关。本研究拟利用蛋白电泳、免疫酶印迹等方法初步鉴定GMBP1结合受体的理化性质及免疫学特性；以GMBP1为探针筛选胃癌耐药细胞cDNA表达文库，克隆、鉴定其结合受体的编码基因；通过生物信息学分析、siRNA技术、药物敏感实验、动物实验等方法，进一步验证它在胃癌MDR中的功能；采用基因芯片、EMSA、报告基因及CHIP等技术，寻找与其相互作用的分子及其信号通路，阐明其参与MDR的分子机制。本课题的开展有可能发现参与胃癌MDR的新分子，为耐药性胃癌的分子靶向治疗提供新靶标。

多药耐药(MDR)是导致胃癌患者化疗失败的主要原因，其分子机制仍不清楚。前期我们通过噬菌体肽库结合MTT实验筛选得到能够特异结合于胃癌耐药细胞的短肽GMBP1，ETAPLSTMLSPY，本课题拟试图阐明该短肽在胃癌MDR中的功能、鉴定短肽结合受体的编码基因、寻找与其相互作用的分子及其信号通路，进而发现参与胃癌 MDR 的新分子为耐药性胃癌的分子靶向治疗提供新靶标。研究证实GMBP1特异性结合的受体分子亚细胞定位于耐药细胞胞浆及胞膜；MTT、药物敏感实验及流式等分子生物学实验发现GMBP1本身对胃癌细胞生长不发生影响，但其能够逆转胃癌多药耐药增加胃癌耐药细胞对化疗药物的敏感性，且western blot结果显示，GMBP1能降低胃癌耐药细胞耐药相关分子p-gp及凋亡相关分子Bcl-2/Bax的改变；为研究短肽在逆转胃癌耐药中所发挥的作用，我们通过western blot、蛋白组学及质谱测序等方法初步获得了GMBP1特异性结合的受体为分子量为78KD的葡萄糖调节蛋白GRP78；为验证受体GRP78是否为短肽特异性结合的靶分子，我们采用激光共聚焦及western blot 分析发现，GRP78与GMBP1在耐药细胞的亚细胞定位及其蛋白表达水平一致且GRP78在胃癌耐药细胞系高表达。采用免疫共沉淀方法孵育获得GMBP1在耐药细胞系特异结合蛋白，并用siRNA技术下调GRP78表达，经western blot分析显示GRP78与GMBP1能互相识别对方受体，证实GMBP1特异性结合的受体为葡萄糖调节蛋白GRP78，western blot及siRNA等实验初步表明GMBP1-GRP78复合物能通过调节耐药相关分子P-gp发挥逆转胃癌耐药的功能。这一发现为我们研究胃癌多药耐药相关分子及机制等工作奠定了基础。