超声破坏微泡联合载内皮抑素基因纳米脂质体治疗肝癌及其机制研究

超声破坏微泡介导基因定位释放技术是一种新型、无创、高效的靶向基因治疗技术，但微泡携带基因量难以满足治疗需要。内皮抑素基因疗法抗血管生成是肝癌治疗的一种重要策略，但目前基因治疗普遍存在靶向性、安全性不够等诸多问题。纳米脂质体是安全、高效的基因载体，但仍存在靶向性和转染效率不够的问题。若以超声微泡结合纳米脂质体介导基因治疗，则可充分整合两者的优势，克服各自的弱点。.本项目将纳米脂质体与微泡共价结合，研制成一种新型、高效的内皮抑素基因载体，再应用超声破坏微泡作用定位释放基因，以提高内皮抑素基因在肝癌血管内皮细胞中的转染效率，从而产生靶向抗肿瘤作用，将为内皮抑素抗肝癌血管基因治疗提供一种新的手段，为人们寻找基因载体和转染方法提供一种新的思路。

目前超声破坏微泡介导基因治疗技术由于微泡载基因量低而导致治疗效果不理想，本课题旨在提高微泡类基因载体的载基因量，以超声破坏微泡作用联合特异性抗血管生成基因内皮抑素，探索一种新型的靶向肝癌基因治疗手段。开展的研究工作总结如下：.1. 研制高效的微泡基因载体，以实现联合超声进行靶向基因治疗的目的。将微泡与纳米脂质体进行连接形成复合基因载体；或是采用低毒性的带正电荷的脂膜材料DC-Cholesterol制备阳离子脂质微泡，以提高载基因量；.2. 通过经典克隆方法构建重组人内皮抑素质粒并采用酶切电泳及DNA测序进行鉴定； .3. 采用超声破坏微泡介导内皮抑素基因转染HUVEC细胞和肝癌HepG2细胞，探讨最佳超声辐照微泡的条件，观察其抑制内皮细胞生长作用以及对血管生成的影响，观察其对肿瘤细胞侵袭、转移和诱导血管生成作用的影响；.4. 在小鼠肝癌H22模型上验证超声破坏微泡介导内皮抑素基因治疗肝癌的实际效果。通过上述研究，我们取得了如下研究成果：.1. 成功研制了微泡-纳米脂质体复合物，但发现其不适宜于进行载基因治疗研究，研制了阳离子脂质微泡，能显著增加载基因量，可作为基因载体联合超声进行下一步的基因治疗；.2. 通过经典克隆方法成功构建了人重组内皮抑素pEZ-M46-ES质粒，为下一步的基因治疗奠定了基础；.3. 超声破坏微泡介导内皮抑素基因转染HUVEC细胞具有较高的转染率，对内皮细胞生长和血管形成具有明显的抑制作用，转染肝癌HepG2细胞后对其侵袭、转移和诱导血管生成具有明显的抑制作用。.4. 超声破坏微泡介导内皮抑素基因转染可明显抑制小鼠肝癌H22移植瘤的生长并抑制肿瘤血管生成，抑瘤率达70.1±12.3%。.课题研究的前期实验根据项目研究计划成功制备了微泡-纳米脂质体复合物，但发现其不适合作为基因载体携带目的基因进行下一步实验，结合国外研究成果对研究方案进行了一定改进，采用制备新型阳离子微泡作为目的基因载体，其提高微泡载基因量目标与原研究方案的思路基本一致，后续的研究结果也基本达到预期目的。受本课题资助，所开展课题实验共发表论著5篇，其中SCI论文2篇，CSCD核心论文3篇，另有关于基因治疗实验结果的SCI论文正在撰写中。受本课题资助，1名博士及两名硕士研究生完成毕业课题研究，共有5人/次参加国内重要学术会议，并邀请了一名国外专家进行学术交流。