DEELA蛋白介导赤霉素调节山药块茎膨大的分子机理

Yam is an important homologous crop of medicine and food, and the tuber is its harvested organ. Different from the inhibition of potato tuber formation and growth, gibberellin can significantly promote the growth and expansion of yam tubers, and increase their yield. However, the mechanism of gibberellin is not yet studied. Based on the isolation of yam DELLA gene and GA20ox1 gene fragment, we used homologous cloning and RACE technology to amplify GA20ox1 and GID1 genes and bioinformatics analysis. The gene expression of different yam varieties, sites and spraying exogenous gibberellin and PP333 was analyzed by fluorescence quantitative PCR. The vectors of DELLA gene overexpression and Cas9 were constructed, and transformed into yam. The agronomic traits, physiological and biochemical and gene expression of transgenic plants were analyzed. To elucidate the possible molecular mechanism of DELLA protein regulating GA20ox1 and GID1, mediating GA regulating endogenous hormone balance and carbohydrate metabolism, and regulating tuber development. The results will be of great significance for elucidating the molecular mechanism of the growth and development of Chinese yam, enriching the theory of tuber shape formation, improving yam genetic improvement and efficient cultivation.

山药是重要的药食同源作物，块茎为其主要收获器官。与抑制马铃薯块茎形成和生长不同，赤霉素可显著促进山药块茎膨大后期的生长膨大，提高产量，但对其作用机理尚缺乏研究。本项目拟在已分离到山药DELLA基因全长和GA20ox1基因片段的基础上，利用同源克隆结合RACE技术扩增GA20ox1和GID1基因全长，进行生物信息学分析；利用荧光定量PCR技术分析不同山药品种、部位和喷施外源赤霉素及PP333下的基因表达；构建DELLA基因过表达和Cas9载体，导入山药，对转基因植株进行农艺性状、生理生化和基因表达分析。以阐明DELLA 蛋白协调GA20ox1和GID1，介导赤霉素调节内源激素平衡和碳水化合物代谢，从而调控块茎发育的可能分子机理。结果对阐明山药块茎生长发育分子机理，丰富块茎形态建成理论，进行山药遗传改良和高效栽培具有重要意义。

山药是单子叶植物薯蓣科薯蓣属植物的地下块茎，是我国重要的药食兼用高效经济作物。前期研究表明， GAs有利于山药块茎的生长发育；DELLA蛋白是赤霉素信号通路中的关键调控因子，参与调控植物器官生长发育。但DELLA蛋白如何参与调控山药块茎生长发育的作用机制尚未见报道。因此研究GAs调控山药块茎发育的分子机制，对高产栽培技术研究，提高山药产量和品质具有重要的指导作用。本项目通过转录组和miRNA测序与块根块茎作物转录组分析，发现差异表达基因CDPK、CaM、CDL、SAUR、DELLA、SuSy和expansin等，参与植物激素信号转导、MAPK信号、淀粉和蔗糖代谢以及碳代谢等过程；多种植物激素如GA、IAA和ABA参与山药块茎生长发育和碳水化合物代谢过程的调控，其中DELLA蛋白基因均上调表达，编码泛素连接酶的GID2下调表达。由此推测外源GAs对山药块茎发育的作用机制可能通过DELLA 蛋白协调GA20ox1 和GID1，介导GA调节内源激素、蔗糖、淀粉、贮藏蛋白代谢，进而调控块茎的发育。在此基础上，通过克隆山药DELLA调控相关系列基因和生物信息学分析，预测其互作关系,获得1个DoGA20ox1，1个DoGA3ox1，4个GA2ox，3个DoGID1、3个DoDELLA，4个DoEXP和6个DoXTH，1个DoSCL3。生信分析表明，3个DoGID1、3个DoDELLA家族成员的核苷酸和氨基酸长度差异较大，亲缘关系远。DoDELLAs在C端具有一个保守的GRAS功能区域，存在两个亮氨酸重复序列（LZ和ployS/T）和三个保守结构域。DoSCF108为F-box蛋白DoGID2基因，与 DoDELLA 蛋白互作系数最大。通过这些基因在山药块茎生长过程中的表达动态及其转基因烟草综合性状分析，揭示DoDELLA蛋白在山药块茎发育中可能存在GA3-DoGID1a-DoDELLA1，GA3-DoGID1b-DoDELLA1，GA3-DoGID1c-DoDELLA1，GA3-DoGID1a-DoDELLA2，GA3-DoGID1b-DoDELLA2，GA3-DoGID1c-DoDELLA2等多条GA反馈调控途径，以DoDELLA1为核心，通过反馈调节GA合成与分解相关基因表达，调控GA3水平，进而调节其下游基因如EXP、XTH基因表达，调控山药块茎的生长与膨大。