DNA甲基转移酶1 (dnmt1) 在斑马鱼胚胎定向造血发育过程中的生物学作用研究

The hematopoiesis regulation networks of zebrafish and mammals are highly conserved, so the zebrafish is an ideal model organism for the research of hematopoiesis. DNA methylation is closely related with the development and tumorigenesis. Dmnt1 is the firstly found DNA methyltransferase of mammals, and its expression is most abundant in cells. Although the study of dmnt1 has already been carried out, but the mechanism of dmnt1 in hematopoietic system is still very limited. Therefore further studies of regulatory mechanism of dmnt1 in hematopoietic system are necessary. In this work we will try to find and identify some directly regulated genes by dmnt1 in wild type zebrafish line, transgenic line as well as dmnt1 mutation line.

斑马鱼的造血调控网络与哺乳动物高度保守，是一种用来发现新的关于调控造血干细胞自我更新和分化的分子机制或分子调控网络的优秀的模式生物体。DNA甲基化与发育和肿瘤发生密切相关。dnmt1是哺乳动物中发现的第一个DNA甲基化转移酶，并且是体细胞中表达量最为丰富的一类dnmt基因。国内外虽然对于dnmt1的功能已有一定的研究，但是对于此基因在造血系统中作用机制的认识还相当局限，因此对dnmt1对造血系统下游靶基因的调控机制仍然需要更为深入细致的研究。我们试图在携带dnmt1突变的斑马鱼家系、野生型斑马鱼和转基因斑马鱼中寻找并鉴定出一些特异的直接受dnmt1调控的相关基因，该工作将为进一步明确dnmt1在造血系统中的作用提供更多的理论基础。

造血干细胞具有自我更新能力，并且可以向下游分化形成各种前体细胞和成熟血细胞。造血干细胞异常增殖和分化都可以导致严重的血液疾病。目前的研究已经发现了部分与造血干细胞自我更新以及分化相关的基因，如bmi1，hoxB4，wnt，pten，hedghog等，但是对整个分子调控网络的认识还十分局限。斑马鱼的造血调控网络与人类高度保守，因此，我们运用斑马鱼为模式生物筛选更多新的与造血干细胞自我更新及分化相关的基因。我们运用N-乙基-N-亚硝基脲（ENU）为化学诱变剂处理雄性斑马鱼，保种获得了近1000家携带有突变基因的斑马鱼家系。通过运用标记定向造血干细胞的分子标记cmyb来筛选具有造血干细胞异常的突变家系，最终获得了200多个突变家系。通过经典的三代遗传学筛选，本课题最终选定了ldd794突变家系进行定位克隆，进一步阐述导致ldd794造血干细胞异常的分子机制。通过定位克隆，我们发现ldd794造血干细胞异常是由于DNA甲基转移酶1（Dnmt1）中的点突变导致蛋白翻译的提前终止。截断的Dnmt1缺失了DNA甲基化催化结构域，失去了甲基转移酶活性。Dnmt1可以通过对新复制的DNA加上甲基基团来调控基因的表达，但是其对造血调控的分子机制并不清楚。. 在dnmt1突变的胚胎中，定向造血干细胞的分子标记cmyb从受精后36小时（36hpf）开始就开始减少，到5dpf时完全缺失。全胚胎dUTP缺口标记（TUNEL）及造血干细胞的双标实验显示细胞没有发生异常的凋亡。通过磷酸化组蛋白3（PH3）的免疫荧光标记实验，我们发现dnmt1突变胚胎中造血干细胞的增殖能力显著减弱。进一步的分子机制研究发现增殖能力减弱是由cebpa基因表达上调所引起的，同时发现cebpa基因的转录调控区域DNA甲基化水平明显降低。过表达转录抑制形式的融合蛋白SUMO2-C/ebpa可以恢复造血干细胞减少的表型。同时，在dnmt1及cebpa双突变的胚胎中造血干细胞数量仍可维持正常，说明cebpa是Dnmt1对造血干细胞调控所必需的一个基因。. 在此课题中，我们运用正向遗传学的方法筛选得到了可遗传的携带有dnmt1突变的斑马鱼家系，并通过分子机制的探索发现cebpa是Dnmt1参与定向造血干细胞调控的一个关键基因。