锦灯笼中具有二相酶诱导作用的化学成分及其作用机制研究

Biological metabolism of toxic substance and xenobiotic mainly depends on induction of phase Ⅱ metabolic enzymes. Research showed that Phase Ⅱ enzyme inducers can protect DNA and proteins from damage produced by reactive oxygen and electrophiles through inducing phase Ⅱ enzymes and possess chemopreventive and anti-inflammatory effects. Many Michael reaction acceptors (MRAs) with phase Ⅱ enzymes induction activities exist in Traditional Chinese Medicine. But how to discover them efficiently and directly still is a problem. In previous work, we established a method with GSH as substrate which can rapidly discover MRAs by LC-MS. Preliminary experiments' results showed there were many MRAs in dichlormethane extract of Physalis alkekengi var. franchetii and they possessed high phase Ⅱ enzymes induction activities. In present study, the suitable substrate will be determined and the method will be established to discover the MRAs with phase Ⅱ enzyme inducing activity from P. alkekengi var. franchetii. The structure-activity relationships of physalins isolated from P. alkekengi var. franchetii are to be explored. The ABPP method based on click chemistry will be employed to find target proteins and distinct protein which involved in inducing phase Ⅱenzyme, and the mechanism of phase Ⅱ enzyme inducing activity of physalin from P. alkekengi var. franchetii will be explained.

机体代谢有毒有害物质主要依靠二相酶的激活，二相酶诱导剂可以通过诱导二相酶的表达，从而免除活性氧或亲电试剂对正常细胞的DNA和蛋白质造成损伤，具有化学预防、抗炎等多方面的功能。研究表明很多中药中存在具有二相酶诱导活性的迈克尔反应受体分子（MRAs），但缺乏快速有效的发现方法。前期研究中我们建立了以还原型谷胱甘肽（GSH）为底物快速发现MRAs的方法。预实验中，我们发现锦灯笼的二氯甲烷部位存在大量MRAs，而且该部位具有较强的二相酶诱导活性。本研究将首先确定合适的反应底物，建立以GSH或Keap1为底物的快速发现中药锦灯笼中具有二相酶诱导活性成分的方法；研究锦灯笼中具有二相酶诱导活性的酸浆苦味素类成分的构效关系；采用基于点击化学的ABPP法合成小分子探针，发现活性酸浆苦味素成分的作用靶点，探索与二相酶诱导相关的特有靶蛋白，阐明锦灯笼中活性酸浆苦味素类化合物的二相酶诱导作用机制。

研究表明很多中药中存在具有二相酶诱导活性的迈克尔反应受体分子（MRAs），但缺乏快速有效的发现方法及有关作用机制的研究。本项目建立了快速发现锦灯笼中具有二相酶诱导活性MRAs 的方法。比较锦灯笼提取物分别与GSH 和Keap1 作用前后的UPLC-MS 谱图，选择GSH作为底物建立基于LC-MS 技术的快速发现锦灯笼中具有二相酶诱导活性的MRAs 的方法。针对消失或减弱色谱峰对应的化合物进行提取分离和结构鉴定，并分析其活性。比较锦灯笼提取物与GSH结合前后的UPLC-DAD色谱图，结果显示至少3个色谱峰与GSH作用后减弱，并且根据质谱数据推测其中2个化合物结构为physalin A和physalin O。对锦灯笼的酸浆苦味素类化合物进行了分析，从中分离得到鉴定了5个化合物，分别为physalin A，isophysalin A，physalin O，physalin L，physalin G。并对这5个physalin进行了GSH结合的分析。结果显示，3个physalin类化合物能够与GSH结合，并且结合能力很强。通过反相制备液相色谱分离，得到单体化合物，通过结构鉴定主要酸浆苦味素类化合物。在对锦灯笼的活性成分研究中，发现了一个具有极佳抗炎活性的酸浆苦味素类迈克尔反应受体分子physalin A，基于micrOTOF-MS对physalin A与IKKβ蛋白半胱氨酸残基的结合位点进行了研究。由于Keap1与IKKβ的降解有关，可以促使Keap1介导IKKβ降解而抑制NF-κB通路，从而具有第三种激活Keap1-Nrf2/ARE信号通路的新途径。结合文献报道，以physalin A为例，设计活性小分子探针的合成途径。由于合成的小分子探针总量较低，对除IKKβ以外的其他作用靶点的研究造成一定影响，课题组已在不断富集原料化合物并优化合成方法，将合成得到足量活性小分子探针后继续探索其他特有靶蛋白。