脂肪酶水解甘油三酯位置选择性的调控和分子机制研究

利用脂肪酶的位置选择性，催化制备的位置异构体化合物是许多药物和保健品的关键成分。位置选择性是脂肪酶重要的底物选择性参数，然而目前脂肪酶结构和位置选择性的关系尚不清楚，因此，研究脂肪酶的位置选择性具有重要的科研和应用价值。本课题针对脂肪酶对甘油三酯三条脂肪酸侧链位置选择性不同的性质，以酶催化甘油三酯水解反应为模型，拟通过定向进化和合理设计相结合的手段，以对甘油三酯无位置选择性的南极假丝酵母脂肪酶基因为模板，建立突变基因库，结合课题组建立的酶位置选择性高通量筛选方法，对酶的位置选择性进行优化，筛选得到具有sn2位置选择性的突变酶。通过对野生型和突变酶结构的分析，对酶位置选择性进行合理设计，进一步优化酶的位置选择性。探讨脂肪酶结构和位置选择性的关系，用理论计算和动力学方法分析脂肪酶位置选择性的分子机制。为对脂肪酶结构进行有效调控，获得具有特殊位置选择性的新酶提供理论和实验依据。

位置选择性是脂肪酶重要的底物选择性参数，然而目前脂肪酶结构和位置选择性的关系尚不清楚，因此，研究脂肪酶的位置选择性具有重要的科研和应用价值。在本课题中我们针对南极假丝酵母脂肪酶B对甘油三酯三条脂肪酸侧链位置选择性不同的性质，以该酶催化不同链长甘油三酯水解反应为模型，通过迭代饱和突变技术和组合的活性位点饱和突变技术等半合理设计和合理设计相结合的手段，通过以对短链甘油三酯无位置选择性的南极假丝酵母脂肪酶B基因为模板，建立突变基因库。通过密码子简并设计进一步提高了筛选效率。结合课题组建立的甘油铜类酶位置选择性高通量筛选方法，对酶的底物链长选择性和位置选择性进行了优化，筛选得到了具有sn2位置选择性的突变酶。通过对野生型和突变体酶结构的分析，以及对酶位置选择性进行的合理设计，进一步优化了酶的位置选择性。我们通过探讨脂肪酶结构和位置选择性的关系，发现南极假丝酵母脂肪酶B底物适应性广，对不同链长的甘油酯类都具有活性和特异性，而且其特异性随着底物链长不同而变化。我们还发现底物活性中心口袋大小和排布方式对该酶位置选择性其关键作用。活性中心口袋扩大有利于提高长链甘油酯的活性和位置选择性，但使短链甘油酯位置选择性降低。另外活性口袋中底物结合部位的排布对该酶的位置选择性取决定性作用，sn2位置选择性突变酶的底物结合区域要明显小于sn1,3，和sn1,2,3型的结合区域。我们推测把sn1,3，和sn1,2,3位置选择性酶的活性口袋区域减小，并使之能够有效结合sn2位置的底物可能是转变酶位置选择性的有效途径。我们的研究为对脂肪酶结构进行有效调控，获得具有特殊位置选择性的新酶提供了理论和实验依据。