偏甘油酯脂肪酶PCL调节温度耐受性的分子机制研究

Mesophile partial glyceride lipases have the poor thermostability and restrict its application in industrial production. In this study, mesophile partial glyceride Penicillium camembertii lipase (PCL) is used to study the amino acid residues associated with its thermostability. The database of protein sequences of mesophile, thermophilic and extremophile lipases is used to calculate and analyze amino acid residues associated with thermostability by the support vector machine method. The molecular modification of PCL is conducted by multi-amino acids substitutionm, and then, the thermostability of enzymes is predicted by support vector machines separator. Site directed mutagenesis is used to construct mutants. After expression and purification of PCL and its mutants, the enzyme properties and thermal kinetic parameters are investigated. This study reveals the molecular mechanism of thermostability of partial glyceride lipase PCL and provides a theoretical basis for the research on the thermostability mechanism of the lipase.

常温偏甘油酯脂肪酶不能满足工业生产中对热处理的要求，制约了其在工业生产的应用。本研究拟选取常温偏甘油酯脂肪酶卡地干酪青霉菌Penicillium camembertii Lipase (PCL)为研究对象，围绕“非活性中心和非骨架结构的氨基酸残基”对酶分子温度耐受性的影响，采用支持向量机方法计算和分析常温、高温和超高温脂肪酶蛋白序列数据集，筛选与脂肪酶温度耐受性相关的氨基酸残基，指导PCL突变体的分子改造。在支持向量机预测模型评估突变体温度耐受性的基础上，通过定点突变等基因工程技术进行突变设计；利用毕赤酵母表达系统制备突变体蛋白，考察突变体蛋白的酶学特性和热催化动力学参数；揭示影响偏甘油酯脂肪酶PCL温度耐受性的分子调控机制。期望通过此研究，可为偏甘油酯脂肪酶温度耐受性机制研究和基因工程改造提供坚实的理论基础。

偏甘油酯脂肪酶（mono- and di-acylglycerol lipase）是一类对底物严格选择特异性的脂肪酶，在油脂和化工行业中具有重要应用价值，其催化甘油二酯水解的最适反应温度是40℃，属于中温酶，严重限制了其工业应用，亟需进行热稳定性改造。本项目基于支持向量机方法，以嗜热和常温脂肪酶的蛋白质序列为特征向量，预测与酶热稳定性相关的潜在氨基酸，运用氨基酸替换法，获得突变体库。结合计算机辅助半理性设计，运用RosettaDesign、FoldX、ABACUS、iStable等软件，采用支持向量机等算法对突变体进行热稳定性计算，经过多轮筛选，获得6个脂肪酶PCL候选突变体，制备突变体蛋白，获得热稳定性提高，酶分子动力学和热力学稳定性改善的突变体PCL。解析中温脂肪酶MgMDL2和高温脂肪酶MAS1晶体结构，探究脂肪酶热稳定性相关的关键结构域。系统分析不同物种偏甘油酯脂肪酶蛋白序列，为基于序列和结构的偏甘油酯脂肪酶热稳定性改造研究提供基础。研究工作共发表6篇SCI科研论文。