基于NAD(H)系统改造与调控的产丁二酸大肠杆菌代谢工程研究

丁二酸是重要的C4平台化合物，目前其重组大肠杆菌生产菌的构建思路主要是围绕增强丁二酸合成途径中关键酶的活性并失活副产物生成途径的关键酶展开。丁二酸是大肠杆菌厌氧混合酸发酵的还原性终端产物，系统还原力的强弱是其合成效率的重要影响因素，而NAD(H)总量及NADH/NAD+比例是调节还原力的分子基础，因此开展其NAD(H)系统的改造与调控对提高丁二酸合成效率具有重要的理论意义与实践价值。本项目拟解析在不同氧化还原电位值、不同还原性碳源和碳限制条件下引起的NAD(H)总量及NADH/NAD+比例变化的分子机制，指导采用分子生物学手段改造大肠杆菌的NAD(H)生物合成与分解途径，有效提高其胞内NAD(H)的总量，并综合利用氧化还原电位等发酵调控手段进一步提高胞内NAD(H)的总量并维持合适的NADH/NAD+比例，确定基于辅酶调控丁二酸的生物合成策略，大幅度提高丁二酸的合成效率。

还原性终端产物丁二酸是重要的C4平台化合物，系统还原力的强弱是其合成效率的重要影响因素，而NAD(H)总量及NADH/NAD+比例是调节还原力的分子基础。本课题采用基因工程改造与发酵调控相结合的手段，提高菌株胞内的NAD(H)总量并维持适宜菌株生长与产物合成的NADH/NAD+比例，从而大幅度提高丁二酸的合成效率。首先，考察了在不同还原性碳源、不同氧化还原电位值等条件下，NAD(H)的合成及分解代谢途径相关酶的转录水平和蛋白水平的变化规律，揭示了引起NAD(H)总量及NADH/NAD+比例变化的分子机制。其次，利用分子生物学手段，调控表达NAD(H)合成途径中的一个或多个基因，以有效提高菌株胞内的NAD(H)总量，并考察其对菌株胞内NADH/NAD+比例的影响，利用代谢分析手段考察分子改造对于菌株产物分布、产物生成速率等影响以反馈指导上述生产菌的构建工作，最终获得系列生产性能优异的改造菌株。此外，进一步结合利用氧化还原电位调控等发酵调控手段提高NAD(H)总量并调节胞内NADH/NAD+比例至适宜值，为丁二酸的合成提供优良的系统还原力条件，大幅度提高丁二酸的合成效率。本课题实施过程中共发表论文34篇，其中SCI 收录17篇，申请发明专利5项，其中5项授权，共培养课题相关博士后1名，硕博士研究生10名。本课题超额完成各项研究任务及指标，综合利用基因工程与发酵调控手段，采用胞内胞外共调节辅酶的方法，实现了微观与宏观两种调控手段的合理结合，确定了基于NAD(H)调控丁二酸高收率、高生产强度的生物合成策略，为建立厌氧发酵制备还原性产物的柔性平台技术打下良好的基础。