葡萄果实中草莓香气组分前体物邻氨基苯甲酸的积累机制

Methyl anthranilate endows grape berries with strawberry-like aroma. Anthranilate is a precursor of methyl anthranilate biosynthesis and greatly varies among species and varieties, which results in different aroma traits between grape berries. However, little was known to date about the mechanism of anthranilate in developing grape berries. The present study aims to expound the mechanism in anthranilate accumulation using two grape species 'Concord' (Vitis labrusca) and 'Moldova' (V. vinifera) as materials. The metabolomics relating to anthanilate synthesis and transformation will be compared between the two species during grape berry development with help of GC-MS and LC-MS; The effects of tryptophan, an inhibitor of anthranilate synthase, on anthanilate synthesis and transformation will be assessed and critical metabolic steps involved in difference in anthanilate accumulation between grape species will be expounded from the view of metabolomics. The expression of the gene encoding anthranilate synthase (ASa) will be analyzed in these two grape species by means of real time PCR and the biochemical properties of VlASa and VvASa will be systemically studied. The molocular metabolism of anthanilate accumulation in grape berry will be elucidated. The findings will provide scientific evidence for directional regulation of methyl anthranilate level in grape berries and eventually for improvement of their aroma quality.

邻氨基苯甲酸是草莓香气组分氨茴香甲酯生物合成的前体物，其在不同种和品种葡萄果实中含量差别很大，从而赋予葡萄不同香气特征，但迄今对该类香气前体物积累机制知之甚少，本研究拟以美洲种'康可'葡萄和欧亚种'摩尔多瓦'葡萄为试材，应用气质联用和液质联用技术系统比较这两种葡萄在果实成熟过程中邻氨基苯甲酸合成及其下游产物相关代谢物组学的差异，研究邻氨基苯甲酸合成酶抑制剂色氨酸对相关代谢物合成流向的影响，从代谢组学角度探明葡萄果实邻氨基苯甲酸积累差异的关键代谢环节；应用荧光定量PCR技术比较不同葡萄果实邻氨基苯甲酸合成酶基因ASα的转录表达，研究VlASα和VvASα生化特性，从基因及酶学水平阐明葡萄果实邻氨基苯甲酸的积累机制，为定向调控果实中草莓香气组分氨茴香甲酯含量以及提升葡萄果实风味品质提供科学依据。

邻氨基苯甲酸是葡萄果实中草莓香气组分的重要前提物质。为揭示其在葡萄果实成熟中的积累机制，本实验选择 ‘摩尔多瓦’、‘康拜尔早生’ 、和‘卡托巴’三种葡萄品种为实验材料，主要开展了以下工作:（1）本实验运用GC-MS、LC-QQQ-MS/MS及HPLC测定了葡萄果实发育过程中邻氨基苯甲酸和其代谢物含量的变化；研究了喷施邻氨基苯甲酸或色氨酸对葡萄邻氨基苯甲酸及相关代谢物积累的影响；（2）克隆并原核表达了以上三个品种中的邻氨基苯甲酸合成酶关键基因ASα1，分析了不同重组ASα1的体外酶活差异；（3）利用转录组测序和qPCR技术，测定了果实成熟中邻氨基苯甲酸相关代谢路径中关键基因的表达变化。.主要结果如下：（1）‘康拜尔早生’果实成熟中邻氨基苯甲酸和氨茴香甲酯含量逐渐升高，而‘卡托巴’和‘摩尔多瓦’中均未检测到两者；喷施邻氨基酸苯甲酸后‘摩尔多瓦’仅可以检测到邻氨基苯甲酸，不能检测到其甲酯，说明该品种合成邻氨基苯甲酸及其酯的能力都较差；（2）三个葡萄品种共克隆出5种ASα1基因型，其中‘康拜尔早生’为ASα1 Ⅰ和Ⅱ，‘摩尔多瓦’中为ASα1 Ⅱ，‘卡托巴’中有三种（ASα1 Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ）；这些基因的核酸序列和假定蛋白序列略有不同，但编码的酶均能催化合成邻氨基苯甲酸，而酶反应动力学参数有较大差异，对应的Km值和Vmax值分布范围分别为0.0085~0.0570 mM和0.0014~0.0023 nKatals mg-1)；（3）ASα1 Ⅱ酶（即‘摩尔多瓦’中的唯一ASα1酶）酶与底物的亲和性最差，这很好的解释了为什么‘康拜尔早生’邻氨基苯甲酸含量远高于‘摩尔多瓦’葡萄；（4）‘卡托巴’中ASα1底物亲和性及对应基因的表达量均与‘康拜尔早生’相当，推测‘卡托巴’合成邻氨基苯甲酸后被快速代谢为其他化合物（如色氨酸）。.以上工作从关键酶基因表达、酶催化特性和相关代谢物流向变化等不同角度揭示了葡萄果实差异积累邻氨基苯甲酸的机制，加深了我们对葡萄果实氨茴香甲酯生物合成机制的认识，这些工作的开展将为葡萄果实草莓香味栽培调控及葡萄香气品质定向改良等后续研究提供科学依据。.