核黄素对载脂蛋白B100折叠的影响及其健康效应的实验研究

Riboflavin is one of essential water soluble vitamins. It serves as coenzymes in energy metabolism. Recently, it was reported that riboflavin deficiency impaired secretion of apolipoprotein B100 in hepatic cells. The underlying mechanism and possible health risks were not clear. Based on a hypothesis raised in this project, we are going to investigate the effects of riboflavin on the formation of disulfide bonds of apolipoprotein B100, which is closely related to its folding. Molecular, cellular and animal tests are conducted. The possible impacts on lipid metabolism, some physical functions are further investigated. It will shed a light on the function of riboflavin and lay a foundation for further study in the future.

核黄素为人体必需的水溶性维生素之一，在体内以辅酶形式参与能量代谢等。近年来有报道认为，核黄素营养不良可导致肝细胞载脂蛋白B100（apoB100）分泌障碍，但具体作用机制及其健康效应尚不十分清楚。本项目在提出假说的基础上，拟通过肝细胞培养，采用分子生物学、生物化学等方法，从apoB100折叠形成的角度，研究核黄素通过二硫键形成途径对apoB100修饰成熟的影响，为进一步探讨核黄素新的生理功能提供理论依据，同时也将为今后深入研究奠定基础。

核黄素又称维生素B2，在体内主要以黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸辅酶形式参与氧化还原反应，与能量代谢密切相关。此外，核黄素还参与维生素B6和烟酸代谢，并作为谷胱甘肽还原酶的辅酶，参与体内还原型谷胱甘肽水平的维持，与体内抗氧化防御体系功能也密切相关。近年来有研究报道显示，核黄素可能还参与apoB100成熟过程，由于apoB100是低密度脂蛋白（LDL）的重要组成成分之一，因此我们推测核黄素通过影响apoB100的成熟过程，有可能间接影响脂质代谢。. 基于上述假说，本项目通过建立了核黄素缺乏肝细胞（HepG2细胞）培养模型，观察了不同核黄素营养水平对肝细胞活力、凋亡、抗氧化功能、apoB100合成过程（包括mRNA与蛋白表达以及二硫键形成过程中相关酶的表达）、内质网应激以及蛋白质组等的影响，探讨了核黄素作用的途径及其生物学机制。研究结果显示，核黄素营养水平对肝细胞活力、凋亡、抗氧化功能具有显著影响，12.76nmol/L是体外培养时核黄素的适宜水平，而当培养基中核黄素浓度低于12.76nmol/L时可造成细胞核黄素不足或缺乏，这一浓度与我们以前经过研究得出的正常人血清核黄素浓度接近；核黄素缺乏后细胞apoB100 mRNA表达显著下降，细胞内外apoB100蛋白含量显著下降，同时，参与apoB100成熟过程的ERO1和PDI mRNA和蛋白表达均显著下降，细胞内质网应激标志性蛋白GRP78和GADD153 mRNA和蛋白表达显著增加，证明核黄素缺乏后除了影响apoB100基因表达外，尚可影响其成熟过程，核黄素缺乏可通过造成细胞内质网应激，影响apoB100合成。进一步采用蛋白质组学方法，全面观察了核黄素缺乏后HepG2细胞蛋白质表达谱的变化。结果发现核黄素缺乏组有37个蛋白出现表达差异达2倍以上的变化，其中13个蛋白表达呈升高变化，24个蛋白表达呈下降变化。出现显著表达变化的蛋白95.4%与物质代谢过程有关，47.2%与氧化还原反应有关，30.6%与电子传递有关。其中一些蛋白是以核黄素为辅酶的酶，而另外一些酶并不依赖于核黄素作为辅酶，提示核黄素可通过其他一些间接途径影响一些酶蛋白的表达，其作用机制和生物学意义值得进一步探讨。