基于细胞凋亡调节基因为靶点的峨参抗肿瘤活性成分筛选及其作用机理研究

峨参是一种多效的尚未开发的川产道地中药材，而且无明显毒、副作用，价格低廉，药源充足。近年来的研究已使峨参的抗肿瘤作用初露端倪。前期研究显示，峨参内酯、石油醚和氯仿萃取提取物具有较强的抑制多种人源肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的作用，但其作用机制不明。鉴于此，我们拟以前期研究为基础，将人源瘤株筛选与分子靶点相结合，以Bcl-2/Bax为靶点，针对Bcl-2/Bax的表达调控信号传导途径，进一步筛选峨参中抗肿瘤活性成分，从NF-кB、STAT3、P53三个主要上游通路和Caspase-3下游通路，弄清其诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制，为最终研究开发抗癌新药打下基础。

1峨参主要化学成分的提取、分离及结构鉴定：通过提取、分离与纯化，得到12种单体化合物（名称略），其中化合物10、11、12均为首次从峨参根中分离得到。.2峨参内酯及峨参内酯衍生物的合成：本项目设计合成了峨参内酯，并通过NMR确认。设计并成功制备了0号、3号、4号、5号、6号衍生物，且经NMR确认。.3峨参抗肿瘤活性：采用MTT比色法，除正丁醇部位外，峨参石油醚、氯仿部位对A549、H460、HEPG2、HELA的活性较为显著；乙酸乙酯部位仅对MG-63有一定的抑制作用；异峨参内酯对MG-63、HELA有一定的抑制作用；峨参内酯对HEPG2、MG-63、B16、HELA有显著抑制作用；单体13号和鬼臼苦素对HEPG2、MG-63 、A549、Hela具有明显的抑制作用；0号、4号衍生物对B16和Hela细胞有显著的抑制作用；其他化合物均无明显作用。.4峨参内酯和峨参多糖体内抑瘤作用：峨参内酯对H22荷瘤小鼠各指标有明显改善，对抑瘤生长有明显抑制作用；而峨参多糖对肿瘤生长无作用，但能改善部分观察指标，延长小鼠生命，降低死亡率。.5峨参抗肿瘤作用机理研究：峨参内酯作用于HEPG2、MG-63、B16、HELA细胞，镜下有明显的细胞凋亡现象，呈时间-剂量依赖性；用其处理以上细胞，均出现不同程度的细胞凋亡特征的DNA梯带，以HEPG2最明显，凋亡程度与其剂量呈正相关。镜下显示：峨参内酯中剂量组bax表达较为明显，模型组和峨参多糖组bcl-2阳性率最高，峨参各组p53都较低。流式细胞仪细胞周期检测峨参内酯能造成HePG2、Hela、MG-63、A549细胞S期阻滞，其效果与紫杉醇无明显差异。峨参内酯对以上细胞凋亡随着药物作用时间的延长逐渐升高，与对照组相比，其促细胞凋亡率明显上升。峨参内酯组与对照组比较，各肿瘤细胞Bcl-2/Bax比值明显降低，而Hela细胞Bcl-2/Bax比值显著低于紫杉醇组。与对照组相比，峨参内酯组细胞内P53的蛋白表达水平升高，促使细胞内NFκB/P65、Stat3的蛋白表达下降。.6峨参内酯及其衍生物急性毒性实验：峨参内酯LD50为151.52mg/kg，其95%可信区间为93.28mg/kg-252.94mg/kg。说明峨参口服急性毒性很大。以2000mg/kg，一次性灌胃20只，观察15d变化。结果显示，4’-去甲峨参内酯口服无明显毒性。