环境胁迫条件下运动发酵单胞菌Psp操纵子的生物学功能及转录调控机制

Zymomonas mobilis has become a preferred host in cellulosic ethanol fermentation for its special characteristic. However, the presence of some environmental stress factors, such as furfural and acetic acid derived from the process of diluted acid hydrolysis, and also the accumulation of ethanol during the fermentation process, which will produce negative effects on its growth and metabolism. In our previous study, the metabolism and transcriptome profiling of Z. mobilis in response to environmental stress were investigated firstly by using metabolism and microarray analysis. We also deduced that Z. mobilis primarily maintaining the integrity of the cell membrane to respond to environmental stress.. Based on our previous studies about transcriptome and metabolism profiling of Z. mobilis under stress conditions, we select a Psp regulon in response to environmental stress via repairing damaged membrane as a research object, and also put forward the "Psp regulon mediated the stress response model in Z. mobilis". The hypothetical model will be elucidated by using transcription control, gene knockout, gene over-expression, immunoblotting, protein interaction and membrane physiology to reveal its expression regulation of Psp gene, biological function, protein subcellular localization and protein interaction, etc. The project will not only make a deep understanding about the molecular mechanism in response to environmental stress, but also provide an important theoretical and technical basis for constructing a higher stress tolerance genetic engineered Z. mobilis strain for cellulosic ethanol in the future.

运动发酵单胞菌是构建纤维素生物质产乙醇及其他生物基平台化合物工程菌的优选宿主之一。但在纤维素生物质转化过程中产生的呋喃甲醛、乙酸等抑制物和发酵终产物对细胞的抑制，已成为纤维素生物质高效转化的重要限制因素和亟待解决的难题。前期我们通过代谢分析及表达谱芯片等技术，揭示了这些环境胁迫因子对该菌代谢和基因转录的影响，并推测该菌主要是通过保持细胞膜完整性来应对环境胁迫的。基于此，本项目选择1个可能在纤维素生物质转化过程中与细胞膜损伤修复相关的Psp操纵子为研究对象，并提出“运动发酵单胞菌Psp操纵子介导的胁迫应答机制模型”，拟通过转录调控、基因敲除、基因过表达、免疫印迹、蛋白质相互作用和膜生理等技术从基因表达、基因功能、蛋白质亚细胞定位及蛋白质相互作用等方面揭示运动发酵单胞菌Psp系统的生物学功能及呋喃甲醛等环境胁迫条件下的转录调控机制，为最终阐明胁迫应答机制和构建高胁迫适应性工程菌株奠定理论基础。

本项目围绕“纤维素生物质转化过程中发酵微生物环境胁迫应答机制”这一制约纤维素生物质高效转化的共性关键问题，提出 “运动发酵单胞菌Psp操纵子介导的胁迫应答机制假设模型”，通过基因转录调控、基因敲除、基因过表达、蛋白质亚细胞定位、蛋白质相互作用和膜生理等技术系统研究了Psp系统的生物学功能及其转录调控机制，得出以下主要研究结果：.（1）优化和完善了运动发酵单胞菌的遗传平台技术。一是针对运动发酵单胞菌缺乏稳定高效的遗传操作体系这一问题，通过构建含有Cas9和sgRNA表达盒的大肠杆菌-运动发酵单胞菌穿梭表达质粒、靶位点选择以及遗传转化体系优化等，建立了CRISPR-Cas9介导的运动发酵单胞菌基因组编辑技术。.（2）通过实时定量PCR技术，对Psp系统的5个基因进行不同胁迫条件下的基因差异表达分析，初步明确Psp基因的转录调控规律；通过基因敲除及基因过表达等方法，结合突变菌株及其超表达菌株的表型分析，初步阐明Psp基因在环境胁迫中的生物学功能；利用细菌双杂交系统研究PspA与PspF、PspB和PspC的相互作用，结合免疫印迹及蛋白质相互作研究，初步明确Psp系统在应对呋喃甲醛、乙酸和乙醇等环境胁迫因子中的生物学功能及应答分子机制。.（3）通过适应性进化（ALE）、转座突变、基因组重组和ARTP等技术手段，获得了多株呋喃甲醛、乙酸和乙醇等胁迫适应能力得到提高的突变菌株资源，为研究Psp基因的生物学功能提供了新的生物学材料，并从分子水平和比较基因组学初步解析了其可能的胁迫机制，实现了5种代谢工程技术在运动发酵单胞菌的首次应用，筛选获得多个抗逆分子元件，相关抗逆运动发酵单胞菌工程菌株应用于牛粪纤维、秸秆及餐厨废弃物燃料乙醇发酵。.（4）在Biotechnology for Biofuels、Microbial Cell Factories及Bioresource Technology SCI期刊上发表研究论文13篇，bioRix论文1篇，核心期刊论文2篇，获国家发明专利授权4项，完成成果评价1项。