DNA修复系统影响运动发酵单胞菌辐射敏感性分子机制的研究

To respond to the impact of DNA damage on genome stability and cell survival, microorganisms have developed a variety of DNA damage repair mechanisms, including homologous recombination (HR) and non-homologous end joining (NHEJ), to ensure the genetic stability. The heavy ion beams may affect DNA repair and thus lead to cell death or genetic mutation, which has been widely used as an advanced and efficient mutagenesis method for microbial breeding practices. Previous studies suggested that Zymomonas mobilis, an important industrial ethanologen, is well tolerated toward traditional mutagenesis with low mutagenesis efficiency, which can be used as a good experimental material for studying the relationship between DNA repair and mutagenesis. In this project, a series of recombinant strains will be constructed using techniques developed in our laboratory, such as endogenous CRISPR-Cas, to introduce exogenous NHEJ and other related systems to affect DNA repair and DNA mutation diversity in Z. mobilis. These recombinant stains along with the wild-type strain ZM4 will then be treated by heavy ion beams. Using classical genetic, next generation sequencing (NGS)-based and bioinformatic analysis, the effect of heavy ion beams and the impact of DNA repair systems on the survival rate as well as mutation types and locations across the genome of Z. mobilis will be investigated. In addition, the correlation between DNA repair systems and the mutagenesis sensitivity of heavy-ion-beam radiation will be further explored. Our studies will help establish a high-efficiency microbial mutagenesis breeding pipeline, and lay a solid foundation to address key issues for high efficiency microbial breeding.

为应对DNA损伤对基因组稳定与细胞存活的冲击，微生物发展了包括同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）在内的多种修复机制来保证遗传物质的稳定。重离子束会影响DNA修复而导致细胞死亡或产生突变，已作为一种先进、高效的诱变手段广泛应用于工业微生物的育种实践。前期工作发现运动发酵单胞菌对传统诱变的耐受性好，诱变效率低，可作为研究DNA修复与诱变关系的良好材料。本项目以运动发酵单胞菌为对象，借助实验室开发的内源CRISPR-Cas等技术体系，引入对诱变后DNA修复及DNA突变多样性有影响的外源NHEJ系统，构建一系列DNA修复系统重组菌株。对这些重组菌株进行重离子束诱变，并通过经典遗传学、二代测序技术与生物信息学等方法鉴定突变体存活率及突变多样性在内的诱变效果，研究外源NHEJ及内源HR修复体系与重离子束辐射诱变敏感性的关系，解决高效微生物育种中的一些关键共性问题，建立高效微生物诱变育种对策。

诱变育种是一种利用物理、化学、生物等多种方式形成DNA损伤，经过筛选培育优质菌种的方法。建立高速有效的微生物诱变育种方法，开发具有成本竞争力的优良菌种是绿色生物制造的关键。运动发酵单胞菌作为一种安全的工业微生物，可以同时适应高乙醇以及低pH，具有优良的工业生产性能。不同诱变策略已用于运动发酵单胞菌遗传改造，并获得了鲁棒性增强、生产效率提高的不同突变菌株。.本项目探究了复合诱变对运动发酵单胞菌的诱变效果，比较了实验室适应性进化（ALE）、重离子束诱变（HIBM）、常压室温等离子体诱变（ARTP）和复合诱变等诱变方式对运动发酵单胞菌基因组改变及获取乳酸耐受突变菌株的效果。首先优化了ARTP诱变方法的条件，确定了运动发酵单胞菌ARTP诱变最适条件。然后应用HIBM、ARTP诱变和ALE的不同复合诱变策略诱变ZNPΔ38，得到了五株耐受30 g/L乳酸（pH 4.0）的突变株，它们比出发菌株的比生长速率提高了约76~129%。同时，借助内源CRISPR-Cas基因组编辑技术，构建了同源重组相关基因recA突变株，并通过野生型和突变株的诱变效果理解内源DNA重组系统对诱变效率的影响。重离子束诱变后的全基因组重测序结果表明recA突变株的突变位点较野生型多。上述五株乳酸耐受突变株的RNA-Seq结果表明出发菌株可能通过上调氧化还原相关基因来维持高乳酸和低pH环境下的生长，而突变菌株在进化过程中因适应胁迫环境而调整细胞代谢，节省氧化还原相关基因上调所需能量用于细胞生长。.综上，本研究优化并确定了运动发酵单胞菌诱变条件，获得了乳酸耐受性增强的突变株，并结合全基因组重测序和转录组学方法探究了复合诱变策略对运动发酵单胞菌的诱变效果，有助于深入解析运动发酵单胞菌乳酸耐受机制。同时，本研究利用不同诱变方法及其组合选育乳酸耐受突变株并通过基因组测序与RNA-Seq转录组方法分析诱变及其组合对野生型与突变株诱变效果的策略为利用复合诱变策略选育优良微生物菌种提供了技术参考，有助于确定基因型与表型的关联，建立高效稳定的诱变育种方法，服务绿色生物制造发展。