呋喃甲醛对运动发酵单胞菌代谢和基因转录的影响研究

运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）是极具潜力的纤维素乙醇发酵菌株，但纤维素稀酸水解物中广泛存在的呋喃甲醛等物质会对其生长及代谢等产生抑制作用，从而导致乙醇发酵效率降低。因此，揭示呋喃甲醛抑制机理对选育和构建具有高呋喃甲醛耐受性的乙醇发酵工程菌株具有重要的意义。但迄今为止，只是对生长和乙醇发酵效率等表观抑制现象进行了初步研究，而抑制机理及其转化途径等尚未得到阐明。.鉴于此，本项目通过从糖转化速率、ED代谢途径2个关键酶酶活分析、细胞内外主要代谢物和基因转录差异等的比较分析，系统研究呋喃甲醛对运动发酵单胞菌的影响，揭示呋喃甲醛直接代谢途径及其相关应答基因，初步阐明呋喃甲醛对运动发酵单胞菌的影响机理。该项目的顺利实施，不仅能够完善人们对运动发酵单胞菌胁迫代谢和基因表达调控机理等的理解，还能通过揭示呋喃甲醛胁迫应答相关基因为构建高呋喃甲醛耐受性运动发酵单胞菌菌株提供重要理论依据。

本项目通过研究呋喃甲醛及乙醇对运动发酵单胞菌代谢及基因转录的影响，得出以下主要研究结果：.（1）通过生长曲线和糖代谢规律的分析表明：在呋喃甲醛（1.0 g/l）胁迫情况下，运动发酵单胞菌的生长受到了抑制。正常情况下，培养至16 h后，可达到其最大OD值（OD600=4.5），而在胁迫情况下，培养24 h，其OD600才达到3.62。相应的，其葡萄糖消耗速率也减缓，培养24 h后，仍有14%的葡萄糖尚未被消耗。而正常情况下，培养12 h后，即可消耗99.38%的葡萄糖。因而导致乙醇产量下降20.54%。而在高浓度呋喃甲醛（2.0 g/l）存在情况下，Z. mobilis不能生长。同样地，在乙醇（5%）胁迫情况下，该菌的生长也受到了抑制。培养36 h后，其OD600才达到最大值（OD600=2.62）。相应的，其葡萄糖消耗速率也减缓，培养24 h后，仍有90%左右的葡萄糖尚未被消耗；培养36 h后，仍有22%左右的葡萄糖尚未被消耗。.（2）通过表达谱芯片技术，从转录组水平研究环境胁迫对运动发酵单胞菌基因转录的影响，筛选得到一批重要的环境胁迫相关的应答基因。在呋喃甲醛胁迫情况下，有433个基因的表达水平发生了变化，其中上调表达的基因216个，下调表达的基因217个。而在乙醇胁迫情况下，有127个基因的表达水平发生了变化，其中上调表达的基因89个，下调表达的基因38个。GO分析结果表明：这些基因涉及细胞膜、代谢、转录调控及未知功能等。同时，我们还对部分关键应答基因通过定量PCR进行基因差异表达分析验证。.（3）建立了插入失活及敲除失活等运动发酵单胞菌的基因敲除方法，成功地构建了5株限制修饰系统基因突变株，优化了电穿孔介导的Z. mobilis遗传转化技术，构建了良好的遗传操作平台。同时，还通过利用运动发酵单胞菌碱性磷酸酶PhoD的分泌信号肽成功构建了1个分泌表达系统。.（4）基于转录组学的研究基础上，选择了20个基因进行基因功能研究。通过基因敲除或过表达等手段，初步解析了这些基因在运动发酵单胞菌胁迫应答及代谢调控中的功能。结果表明：部分基因与胁迫应答相关；部分基因可改变ED代谢途径，从而具有合成丁二酸的能力。.（5）以运动发酵单胞菌为核心，建立了利用以竹子生物质资源、16种人工湿地植物资源及右旋糖苷工业废水等为为底物的乙醇发酵工艺技术路线。