基于二氢叶酸还原酶的磺胺增效剂类药物多残留快速检测分析研究

Sulfonamide potentiators are members of the 2, 4-diaminopyrimidine class compounds including a plurality of structurally similar drugs and widely used in veterinary practice for the treatment of infectious diseases and as growth-promoting feed additives. Illegal use of sulfonamide potentiators or non-compliance of animal-treatment protocols may cause the residues in animal-derived food and seriously infects food safety and human health. Traditional antibody could recognize molecular structures of drugs very fine which limits the development of rapid bioanalysis for muti-sulfonamide potentiators. In the project we proposed, the molecular recognition mechanism between the receptor protein, dihydrofolate reductase (DHFR), and sulfonamide potentiators will be investigate to provide the theoretic foundation for vitro protein evolution and increasing the sensitivity of the rapid bioassay. We try to clone, express and purify DHFR and DHFR mutants form sensitive bacterial strains to select ideal DHFR. The best competitive haptens will be selected to develop rapid bioassay based on DHFR for muti-sulfonamide potentiators for the first time. The project presents novel strategy and method and should be useful and significant for muti-sulfonamide potentiators detection.

磺胺增效剂是一类2,4⁃二氨基嘧啶类化合物，包含多个结构类似的药物，是当前畜牧养殖业应用最广泛的兽药之一，其残留在动物源性食品中会危害消费者健康。由于抗体对分子结构具有精细的识别能力，传统的基于抗体的生物分析技术难以实现磺胺增效剂的多残留定量分析。本项目拟以磺胺增效剂类药物的受体蛋白二氢叶酸还原酶（DHFR）为研究对象，初步阐明DHFR与磺胺增效剂的分子识别机制，为蛋白的体外进化和方法灵敏度提高奠定理论基础；应用基因工程技术克隆、表达、纯化和鉴定来源于磺胺增效剂类药物敏感菌株的重组天然DHFR及其突变体，筛选理想重组DHFR；选择最佳竞争半抗原，建立基于理想重组DHFR的磺胺增效剂多残留快速生物分析方法。本项目首次建立基于DHFR的磺胺增效剂类药物多残留快速检测方法，为此类药物残留有效监控提供了新的研究思路和技术方法，具有较重要的理论意义和应用价值。

磺胺增效剂是一类2,4二氨基嘧啶类化合物，包含多个结构类似的药物，是当前畜牧养殖业应用最广泛的兽药之一，其残留在动物源性食品中会危害消费者健康。由于抗体对分子结构具有精细的识别能力，传统的基于抗体的生物分析技术难以实现磺胺增效剂的多残留定量分析。本项目筛选出了对磺胺增效剂类药物敏感的肺炎链球菌R6和金黄色葡萄球菌ATCC 29213菌株，并体外克隆并表达了二氢叶酸还原酶，其大小均为20 KDa。通过酶活力测定，发现该蛋白有活性；分子对接可知氢键和疏水作用力是该受体与磺胺增效剂配体相互作用的关键，氨基酸残基Gln95, Thr121,Phe92和Ser49是其作用的关键氨基酸。选择TMP-J-EDF为最佳荧光标记物，建立了基于DHFR的磺胺增效剂类药物多残留荧光偏振分析方法，五种磺胺增效剂类药物的IC50值为17.61-143.94 ng mL-1。本项目首次建立了基于DHFR的磺胺增效剂类药物多残留快速检测方法，为此类药物残留有效监控提供了新的研究思路和技术方法，具有重要的理论意义和应用价值。本项目共计培养1名研究生，发表2篇SCI文章（其中第一标注1篇），申报国家发明专利1项。