天然产物中新型三元环基团环丙基形成的酶催化过程研究

The natural products of the yatakemycin family are novel DNA alkylating antitumor antibiotics, including yatakemycin (YTM), duocarmycins, and CC-1065. All members possess a spirocyclopropyl group, which is the DNA alkylating pharmacophore. The IC50 of the cytotoxic activity is as low as pM, so these molecules are regarded as potential star agents for the development of antibody drug conjugates for antitumor drugs. Our previous studies preliminarily proved that an oxygen sensitive coproporphyrinogen-III oxidase YtkT was required for the YTM cyclopropyl group formation, which suggested a completely novel enzyme catalyzed cyclopropyl biosynthesis process. In this project, based on the cloned biosynthetic gene clusters for YTM and CC-1065, and some gene inactivation mutants, we further focus on the novel biosynthesis process of the cyclopropyl group by combining in vivo genetics and in vitro biochemical assays. Therefore, the results of this project will not only disclose a novel way for cyclopropyl formation, but also benefit for future discovery and update of novel antitumor antibiotics using synthetic biology technology.

谷田霉素家族天然产物是一种新型的抗肿瘤抗生素，目前成员包括谷田霉素、多卡霉素和CC-1065。该家族成员都含有一个接环丙基的苯并二吡咯亚基，而环丙基为DNA烷基化活性位点（药效基团）；这种独特的化学结构赋予了它们显著的生物学活性，对细胞毒性IC50达到pM级，因而可以作为抗体药物偶联类抗肿瘤药物研发的潜在明星分子。我们课题组前期工作初步证明谷田霉素环丙基的生物合成需要一个关键的对氧敏感的粪卟啉原III-氧化酶YtkT的参与，这暗示着谷田霉素环丙基的形成采用了一种全新的酶催化方式。在本项目中，我们以谷田霉素和新克隆的CC-1065基因簇为研究材料，进一步采取体内遗传与体外生化实验相结合的方法阐明该类化合物中新型环丙基形成的完整生物合成过程，并初步探讨蕴藏其中的酶学机制。因此，本项目预期结果将揭示一种全新的环丙基形成的酶催化过程，也为将来用合成生物学方法合成新的类似物提供理论基础。

苯并二吡咯家族天然产物是一种新型的抗肿瘤抗生素，目前成员包括谷田霉素、CC-1065和多卡霉素。该家族成员都含有一个接环丙基的苯并二吡咯亚基，而环丙基为DNA烷基化活性位点（药效基团）；这种独特的化学结构赋予了它们显著的生物学活性，对细胞毒性IC50达到pM级，因而可以作为抗体药物偶联类抗肿瘤药物研发的潜在明星分子。.我们课题组前期工作初步证明谷田霉素环丙基的生物合成需要一个关键的对氧敏感的粪卟啉原III-氧化酶YtkT的参与，这暗示着谷田霉素环丙基的形成采用了一种全新的酶催化方式。在本项目中，我们以谷田霉素和CC-1065生物合成基因簇为研究材料，继续采取体内遗传与体外生化实验相结合的方法揭示了一种全新的环丙基形成的酶催化过程，也为将来用合成生物学方法合成新的类似物提供理论基础。.我们在CC-1065生物合成基因突变体中分离到了四个中间体化合物，并且依据其中的7-羟基-CC-1065化合物的结构，我们提出了一条略微与前人不一致的生物合成途径。随后我们进行了同位素喂养实验，而喂养实验结果支持我们的假说，从而修正了前人的喂养结论。.在CC-1065体系我们还发现一个HemN家族自由基S-腺苷甲硫氨酸（SAM）蛋白（C10P）和一个O-甲基转移酶（C10Q）是环丙基结构单元形成所必需的，并且它们的突变体都积累一个同样的环丙基缺失的中间体。随后我们体外生化实验成功证明由C10P和C10Q组成的双酶体系在严格无氧的条件下可以实现该中间体的环丙烷化，从而生成CC-1065。我们在酶活体系中通过质谱检测到了一个关键的SAM-底物中间体，结合同位素标记实验我们提出了这类环丙基形成的过程。.在对谷田霉素基因簇进行基因敲除、回补和生化实验发现一个GyrI-like蛋白YtkR7能够水解谷田霉素的环丙基，随后我们从数据库中鉴定了大量的YtkR7同源蛋白可以水解谷田霉素和CC-1065的环丙基结构单元。我们通过晶体结构和计算生物学揭示了相关的水解机理。最后通过抑菌实验我们发现这类酶可以赋予微生物对谷田霉素产生相应的抗性。