PM2.5引发细胞内甲基化水平变化的纳米孔快速灵敏检测

As the air pollution is becoming more and more severe, and the study of its effects is gradually focusing on fine particulate matter (PM2.5) since it would induce cancer. The reason has been confirmed that the methylation levels in cells would be affected. Therefore, we want to introduce a rapid and sensitive method to identify the DNA methylation. In this proposal, we intend to use the nanopore technique on the identification of cytosine and 5-methyl cytosine at the single molecular level. Moreover, we would analyze the intracellular methylation levels after the normal cells exposing under a certain concentration of PM2.5 for the different period. We hope this method, especially with no need for PCR amplification and labeled probes, could help us to further and deeper study the environmental toxicology of these fine particulate matters. Meanwhile, it can support more studies on the role of DNA methylation in tumor formation, as well as in cancer prevention, diagnosis, treatment, prognosis and etc.

暴露在大气细颗粒污染物环境中会引起细胞内甲基化水平的变化，从而导致癌症。建立一种无需前处理且能高灵敏快速检测甲基化DNA的方法，对于研究PM2.5对人体细胞的影响机制具有重要意义。本项目拟利用纳米孔道这种新型电化学技术对单个胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶分子进行检测，建立一种无需标记分子以及PCR扩增等复杂前处理过程的检测方法，以期在单分子水平上获得胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶分子的特征阻断信号。进而研究在PM2.5环境中暴露的细胞中甲基化水平的变化过程，以此为大气细颗粒物的环境毒理学研究提供更多的科学依据。进一步地研究DNA甲基化在肿瘤生成中的作用，为肿瘤预防、诊断、治疗和预后等方面的研究提供更多基础数据。

本项目发展了一种针对由大气细颗粒物（PM2.5）暴露引发的细胞内DNA甲基化的纳米孔道快速检测新方法。整体的研究内容分为两个部分进行，首先是验证了基于纳米孔道单分子传感的DNA甲基化测定方法可行性。以野生型蛋白纳米孔道Aerolysin为传感界面，构建了短链胞嘧啶-腺嘌呤（5’-CAAA-3）模型链，及其甲基化产物（5’-mCAAA-3’），并利用其以单个分子形式过孔时产生的特征电流信号强度，实现了甲基化和非甲基化DNA片段的区分。由于Aerolysin纳米孔道对上述两种待测物表现出了极高的电流分辨率，即使是对不同浓度比例的混合物样品中也能实现优异的定性检测。此外，Aerolysin对DNA片段的捕获率极高，在5分钟响应时间内就可以记录上万个单分子信号，因此该方法的实际检出限预计可达到纳摩尔级别。另外定量检测的准确性不会受到复杂分析环境（如血清）的影响，足见该方法的鲁棒性。第二部分则是验证了细颗粒物暴露对胞内DNA损伤的影响。以柴油机尾气颗粒DEP为研究对象，以永生化的支气管上皮细胞（BEAS-2B）为模型体系。在暴露24小时后，可以明显观察到BEAS-2B细胞对DEP颗粒的吞噬，并且胞内颗粒个数与DEP浓度正相关。进一步分析显示，中高浓度的DEP暴露可以破坏BEAS-2B细胞膜的完整性，导致胞内活性氧水平上升，并最终造成DNA损伤，抑制BEAS-2B细胞的增殖活力，并大幅提升细胞晚期凋亡率。最后，利用纳米孔道实现实际样品DNA损伤的直接检测仍存在样品制备和纯化的难题，将在后续研究中进一步展开。