高灵敏纳米孔检测技术用于蛋白质构象变化的研究

The conformational dynamics of protein has important scientific significance for understanding the relationship between protein function and structure. At present, the technical means of studying the conformational dynamic still has some limitations simultaneously achieving of high temporal and spatial resolution on single molecular-level. Protein nanopore-based DNA sequencing studies have demonstrated promising achievement on single molecule detection with high temporal and spatial resolution. However, the direct application of nanopore sequencing on protein dynamics study was currently limited to DNA process enzymes. To address these limitations in this proposal, we aim to develop a universal nanopore detection method for protein conformational dynamics research based on high sensitive MspA protein nanopore device with a linked DNA marker molecule. We will investigate the site specific bioconjugation technique with bio-orthogonal reaction to build protein-DNA-nanopore complex, to transmit the conformational movement of the target protein to the sensing site of the nanopore with the linear ssDNA marker, therefore to achieve purpose of the fast and sensitive detection of protein dynamics. Based on this technique, we will study a series of protein for as potential drug targets or bio-engineering industrial application.

蛋白质构象涨落对理解蛋白质功能和结构的关系有重要科学意义，目前研究蛋白质构象涨落的技术手段仍然具有一定的局限性，或无法达到单分子的灵敏度，或无法同时兼备高时间、空间分辨率的需求。基于纳米孔的DNA测序研究已经证明这种单分子检测技术具有较高的时间和空间分辨能力。因此，本项目拟研究一种基于纳米孔的蛋白质构象涨落研究方法，通过开发相应的蛋白修饰技术，利用单链DNA碱基序列作为埃米/纳米尺度位移的标尺将目标蛋白的构象变化传导到纳米孔的传感部位，从而达到构象涨落的测量目的，实现高时间、空间分辨能力和较高的灵敏度。在此基础上进行一系列具有药用靶点价值和工程价值的蛋白质的构象涨落研究，为后续药物分子-靶点蛋白互作的研究以及工业用蛋白功能提升奠定基础。本项目的实施将大力推动蛋白质构象研究的发展，推进纳米孔器件的研究和应用，提升我国在该领域的国际地位。

蛋白质在生命活动中行使多种重要的功能，这些功能与其氨基酸序列息息相关，因此研究蛋白质的氨基酸序列具有十分重要的意义。以Edman降解法和质谱法为代表的主流测序技术应用广泛，却也面临成本高效率低等挑战。而基于单分子的蛋白质测序技术不断发展，特别是纳米孔技术，在DNA测序领域已实现商业化。但由于缺少合适的可控制多肽低速穿过纳米孔的马达蛋白，导致纳米孔技术在蛋白质（多肽）测序研究中进展缓慢。为了解决多肽控速通过纳米孔的问题，我们发明了一种建库控速的方案：我们设计将DNA和多肽进行共价连接，通过DNA控速蛋白MTA-h解旋酶在ssDNA上移动来实现间接控制多肽通过纳米孔，通过检测这个过程中的纳米孔离子电流，我们可以获得与多肽序列信息相关的电流信号波形图，从而有可能推断出多肽的氨基酸序列信息。我们的控速技术获得了读长达到17个氨基酸长度的序列和磷酸化修饰分辨能力的纳米孔电流信号波形。通过对电流信号中毛刺事件的停留时间和相对振幅的统计分析，我们提出了带正负电荷的氨基酸残基替换影响多肽在纳米孔中运动的力学模型，为下一步测序分辨率的提升指明了方向。同时，我们也发现融合表达的双MTA-h可以实现同一条多肽的多次检测，大大提高了纳米孔多肽测序的准确率。通过本项目的研究，我们提出了一种纳米孔多肽测序的可行性方案，为实现高通量蛋白测序奠定了基础。