去甲基化酶TET1参与围手术期应激延迟术后切口痛的表观遗传调控机制

Chronic postoperative pain (CPSP) is a common clinical problem, however, little is known about the mechanism. Though it has been revealed that perioperative stress caused the CPSP, the underlying mechanism remain unclear. The preliminary experiments suggest that perioperative stress do delay the pain recovery time, moreover, the demethylation enzyme TET1 expression decreased and MOR expression increased were found in postoperative incision pain rat, which hasn’t been reported by now. Applied to the sleep deprivation incision pain model(have been published by applicant) , this study using Elisa, qPCR, Western blot, CHIP, SiRNA, HSV-TET1 overexpression, ganglion microinjection, intrathecal injection, DRG cell culture, dual luciferase report, single-cell PCR, immunofluorescence staining, CPP, electrophysiology, DNA Dot blotting and TAB-Seq experimental methods, to explore the mechanism of TET1 invoved in postoperative chronic pain, thus illuminating the participation of epigenetic mechanism in chronic pain and providing a new idea for chronic pain treatment.

慢性术后疼痛（chronic post-surgical pain syndrome，CPSP）是临床常见的难题且机制不明。 已有研究表明围手术期患者的心理及躯体应激能导致CPSP的发生，但具体机制不明。前期预实验显示，围手术期应激可延迟术后切口痛恢复且导致去甲基化酶TET1的下降，目前尚无相关文献报导。本研究以围手术期心理精神因素对慢性疼痛的转归为背景，采用睡眠剥夺机制制作急性疼痛向慢性疼痛转变的动物模型（申请人已发表），利用 Elisa、 qPCR、 Western-blot、CHIP、SiRNA干扰、HSV病毒包装克隆TET1全CDS、神经节显微注射、鞘内置管给药、原代神经元细胞的培养、双荧光素酶报告基因、单细胞PCR、免疫荧光、CPP、电生理、DNA Dot blotting、TAB-Seq等实验方法，探索TET1参与术后慢性疼痛发生的机制，对更全面阐明表观遗传参与疼痛调控提供理论

慢性术后疼痛是临床常见的难题且机制不明。择期手术的患者往往因焦虑、紧张、环境嘈杂导致睡眠不足，这可能引起患者的神经内分泌紊乱，并且与慢性术后疼痛发生密切相关。本研究采用围手术期应激延迟术后切口痛的动物模型，首次发现围手术期应激造成慢性术后痛大鼠的背根神经节及脊髓内的去甲基化酶TET1的蛋白表达降低，进而使μ阿片肽受体和κ阿片肽受体基因的启动子区甲基化状态发生改变，从而延长术后痛。并发现TET1的表达受糖皮质激素受体负调控。本研究阐明了围手术期应激延迟术后切口痛的调控机制，为神经病理性疼痛的治疗提供了新思路。该项目主要的研究内容：（1）利用围手术期的切口痛模型探索术后慢性疼痛甲基化酶的变化，明确TET1是参与术后切口痛的表观遗传机制之一；（2）探索TET1对下游蛋白μ阿片肽受体和κ阿片肽受体的调控机制；（3）探索导致TET1变化的上游机制----应激导致的糖皮质激素的增加致使糖皮质激素受体负调控TET1的表达；（4）通过外源性改变TET1可调控MOR与KOR的启动子区甲基化状态影响疼痛的发生发展。通过上述研究内容可得出如下重要结果（见附件图1-9）：围手术期大鼠于睡眠剥夺应激后，血清糖皮质激素升高，CHIP实验和双荧光素酶报告基因验证糖皮质激素可直接作用于TET1的启动子区并负调控其表达。高通量测序结果显示TET1的表达下调可以使IN+S组术侧DRG内的MOR和KOR启动子区5hmC减少， 5mC增加，致使MOR和KOR的表达下调，术后切口痛延长。逆转TET1的表达可有效阻止术后慢性痛。本实验阐明了围手术期睡眠剥夺应激对慢性痛发生的机制，证实了糖皮质激素受体对TET1的负调控作用，以及TET1对阿片肽受体基因甲基化的影响，为治疗慢性术后切口痛提供新方法，为围手术期的临床管理开拓新思路。