抗乙肝表面抗原单链抗体嵌合抗原受体基因转导T细胞清除肝外组织HBV微量病毒库的研究

Long term use of current anti-hepatitis B virus drugs can control HBV DNA copy numbers in most chronic HBV infected patients (CHB). However, HBV can not be cleared completely and cause virus resurgence after stopping medication. The clearance of minimal residual HBV is dependent upon reconstitution of patients’ HBV specific T cell responses. Anti-HBV surface antigen single chain antibody gene transduced T cell （αHBsAg-CAR-T） technology is able to restore HBV specific T cell response by making T cells acquire HBV specific recognition ability from HBV infected patients, where the HBV specific T cells were exhausted due to HBV infection. In this study, minimal residue HBV positive liver transplantation recipients will be objectives for study. Single chain gene of HBV surface antigen specific mAb from a complete recovered HBV patient will be used to construct HBsAg-CAR gene vector to transduce patients T cells to obtain HBsAg-CAR-T cells. Those cells will be studied for their ability in clearing minimal residue HBV in bone marrow CD34+ cells and PBMCs in vitro. By establishing animal model which mimic extra-liver infection of HBV after liver transplantation, the safety and effective dosage of HBsAg-CAR-T cells will be studied, and the relationship between HBV clearance and reconstitution of anti-HBV specific T cell response will be evaluated.

抗乙肝病毒（HBV）药物可控制大多数患者的HBV DNA拷贝数，却难以清除病毒，造成停药后病毒反弹。彻底清除患者体内的HBV“微量病毒库”，依赖于患者抗HBV特异性T细胞免疫应答的重建，是HBV治愈的关键。通过抗乙肝表面抗原单链抗体嵌合抗原受体基因转导T细胞(αHBsAg-CAR-T)技术，可使患者T细胞重获识别HBV的能力，重建HBV免疫应答。本研究以确诊HBV微量病毒库阳性的肝移植患者为研究对象，使用来源于感染痊愈患者的HBV表面抗原特异性抗体基因构建HBV-CAR基因载体，获取患者αHBsAg-CAR-T细胞，体外研究患者自体包含HBV微量病毒库的骨髓CD34+细胞和PBMCs细胞中病毒清除；建立动物模型，模拟肝移植术后HBV肝外感染，利用HBV-CAR-T细胞进行CAR-T使用的安全性和有效性剂量摸索，并初步观察其清除HBV微量病毒库的有效性与抗HBV特异性T细胞重建的关系。

慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B，CHB）是全球所面临的重大传染病问题，已有的治疗手段都难以彻底清除乙肝病毒。CHB是由于患者杀伤HBV的T细胞数量、功能异常，不能彻底清除病毒，导致慢性炎症和肝癌。抗乙肝表面抗原单链抗体嵌合抗原受体基因转导T细胞(αHBsAg-CAR-T)技术，可使患者T细胞重获识别HBV的能力，重建HBV免疫应答。肝移植患者正是较好的利用HBV特异性T细胞进行免疫重建，预防再次癌变的模型。本研究构建了高效转导T细胞的HBV-CAR慢病毒，获得的HBV-CAR-T细胞在体外培养过程中可保持较高活率和扩增倍数。体外细胞实验证实了HBV-CAR-T细胞可特异性的识别HBsAg+的肝癌细胞，促进杀伤性细胞因子分泌水平升高，对比未转导T细胞和Mock转导T细胞，其对HBsAg+的肝癌细胞PLC/PRF/5、HepAD38和HepG2.2.15的杀伤率显著升高达90%以上，可有效降低培养上清液中HBV DNA的含量。为了进一步验证此功能，我们还优化了人原代肝细胞体外长期培养的条件，获得了人诱导肝细胞(hiHeps)以期构建HBV+正常人肝细胞模型，用以验证HBV-CAR-T细胞体外杀伤HBV+细胞的能力。另外我们还发现，不仅在细胞实验中，HBV-CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养能显著促进细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2、GM-CSF的释放，还可显著促进小鼠体内IFN-γ和TNF-α水平的提高，抑制小鼠肝癌皮下成瘤模型的肿瘤生长，大量浸润肿瘤组织并使其坏死，在靶抗原HBsAg的刺激下在体内增值，保持较强的存活力，并可预防肝癌种植。综上，本课题成功构建了可特异性识别HBsAg+的HBV-CAR-T细胞，证明该HBV-CAR-T 细胞具有很强的识别并杀伤HBsAg+细胞的能力，有希望使用自体HBV-CAR-T细胞重建肝移植患者抗HBV T细胞免疫，同时为肝移植术后肝癌复发提供了新的治疗思路。