贵州地区手足口病分子流行病学分析及EV71抗原表位多肽疫苗的实验研究

Hand foot mouth disease (HFMD) mainly affects infants and children below 5 years old, sever individuals may suffer for neurological complications, or even death. Nowadays, HFMD has been already an importance safety concern of public health in China, and the morbidity of HFMD in Guizhou area is increasing and it is jeoparding the health of local children. The main causative pathogens of HFMD is human enterovirus 71 (EV71) and coxasckie virus A 16 (CVA16), and the neurological complications is always induced by the former. In order to understand the transmitting traits of HFMD in Guizhou area, this study is going to collect clinic samples of HFMD during 2013-2015 and perform retrospective investigation; classify HFMD pathogens by RT-PCR;draw phylogenic tree and perform bioinformatic analyses according to the whole genomic sequence of EV71; attempt to discover the determinant viral factor by correlating with clinic symptoms; reveal the regions by which the constructive protein of virus links to neutralizing antibody, further synthesize peptides of these regions and immunize mice; observe the protective effects of these epitope vaccine on the neonatal mice against EV71. By systematically presenting experimental research of HFMD pathogens and vaccine, this study aim to provide critial basis for the prevention and control of HFMD in Guizhou area.

手足口病(hand foot mouth disease,HFMD) 是由肠道病毒71型（human enterovirus 71，EV71）和柯萨奇病毒A组16型等引起的5岁以下儿童肠道感染性疾病，可并发神经系统症状，甚至死亡。近三年来贵州地区HFMD聚集性发病率从30/10万-40/10万逐年上升，目前EV71的基因变异多样性和抗原表位与机体的保护性详细机制未明。本研究拟采集培养2013-2015年HFMD患儿临床样本,对HFMD进行回顾性调查；逆转录PCR鉴定HFMD病原体类型；对EV71的病毒全基因组进行生物信息学分析；尝试发现决定病毒毒力的决定因子；采用间接ELISA法揭示EV71抗原表位决定区域，将这些多肽片段合成并免疫小鼠，观察抗原表位多肽疫苗保护新生小鼠的作用。通过系统地对贵州地区HFMD病原体研究及EV71疫苗实验研究，为贵州地区预防控制HFMD提供重要的依据。

1.研究内容. 收集2012-2015年贵州各地区手足口病（HFMD）患儿咽拭子样本，鉴定其病毒类型，分析其病原学特点，重点研究肠道病毒71型(EV71)分子流行病 学特征；通过测定、分析EV71毒株的全基因组序列，探索EV71病毒核酸序列和HFMD临床特点的关系，寻找EV71病毒毒力决定位点；并进一步针对病毒主要的致病因子VP1进行抗原表位多肽疫苗实验研究，为贵州地区HFMD防控提供重要的理论依据。. 2.重要结果和关键数据. 本研究共收集贵州地区2012-2015年HFMD咽拭子样本1603份，其中重症病例样本1286份，普通型病例样本317份。从中选取重症样本540份，普通型样本100份纳入研究。经病毒核酸鉴定，结果表明贵州地区导致重症HFMD的病原体主要为EV71病毒。将核酸检测鉴定为EV71病毒的样本进行体外培养、增殖、全基因组扩增、测序，获得17株EV71病毒的全基因组序列，然后对其进行全基因组及遗传进化分析。. 17株EV71分离株全基因组分析研究表明，其基因全长均为7405 bp ,共编码2193个氨基酸，未发现氨基酸插入或缺失，符合肠道病毒71型基因特征。. 17株EV71分离株核苷酸和氨基酸相互比对分析表明，全基因组氨基酸共存在12处氨基酸突变，5'UTR存在12处碱基突变，3’UTR 存在8处碱基突变，尚未发现这些突变与疾病严重程度存在相关性。. 分析17株EV71分离株基于VP1编码区、5'UTR及3’UTR核酸序列，发现其同源性均较高，遗传进化分析表明其基因型均属于C4a亚型。. 最后，课题组利用EV71分离株VP1编码区序列，制备出19段多肽片段， 结合EV71病毒感染病愈患儿血清抗体，共筛选出3段免疫原性较好的VP1多肽片段，将它们与佐剂混合制成疫苗进行动物实验研究，结果证实其对小鼠具有免疫保护作用。. 3．科学意义. 本研究明确了2012-2015年贵州地区重症HFMD的主要病毒类型，揭示了贵州地区EV71病毒的基因特征，阐明了EV71病毒在贵州的分子流行病学特点，为贵州地区重症HFMD防控策略制定提供了重要的理论依据。