多态蛋白状态转变的单分子荧光研究

Metamorphic proteins can have multiple exchangeable states and play critical roles in life procedures, such as signal transduction and cell division. These proteins have close relation to diseases and their treatment. On the other hand, the transition between states is the key step to regulate the role of these proteins. However, the transition mechanism is not clear yet and there are still difficulties to regulate the state transition. With more and more metamorphic proteins discovered, study on the transition mechanism, as new questions in protein folding, has been a hot spot. This project will integrate rapid kinetics, single-molecule FRET, time-resolved single-molecule fluorescence and computational simulation to investigate the state transition mechanism and the properties of different states of metamorphic proteins. This project will include the application single-molecule FRET to the new area of protein folding and the development of time-resolved single-molecule FRET. The completion of this project will provide important experimental and theoretical evidence for deep understanding of the state transition mechanism of metamorphic proteins. It will also facilitate further understanding the biological significance of metamorphic proteins and the treatment of relative diseases.

多态蛋白在生理条件下存在多种可相互转变的状态，它们在信号转导、细胞分裂等生命过程中起到重要作用，跟疾病的发生与治疗有着密切的关系，多态蛋白状态间的转变正是调控这类蛋白功能的关键步骤。但是，多态蛋白状态转变的机理还不清楚，对状态转变的调控还有诸多障碍。随着越来越多的多态蛋白被发现，作为蛋白质折叠研究中的一类新问题，多态蛋白状态转变机理的研究成为了一个新的热点。本项目将结合快速反应动力学技术、单分子荧光共振能量转移技术、单分子时间分辨荧光技术以及计算机模拟等多种生物物理化学技术，重点研究多态蛋白状态转变过程的分子机制以及各状态的动态特征，本项目既包括了现有技术在多态蛋白这一研究领域的新应用，也包括时间分辨单分子荧光共振能量转移这一新技术的开发。项目的开展将为深入认识多态蛋白的状态转变机理提供重要的实验和理论依据，并将为全面认识多态蛋白的生物学意义以及相关疾病的治疗奠定基础。

多态蛋白状态间的转变对于这类蛋白功能的实现以及蛋白功能的调控具有关键作用，认清多态蛋白折叠机理及状态转变机理对于相关疾病的治疗和药物设计具有深远的意义，但是目前对于多态蛋白折叠及状态转变的研究还较少，对其机理的认识还非常有限。本项目拟将多种生物物理技术相结合，对多态蛋白的折叠及状态转变过程进行系统的研究，以期揭示其分子机制，并为对多态蛋白状态转变的调控提供实验和理论依据。.在过去四年中，本项目在以下几个方面开展了研究：1）利用动力学及热力学技术方法对Mad2折叠及状态转变机理进行了研究；2）对Mad2与其配体Cdc20的相互作用进行了系统研究，对结合常数及结合动力学进行了表征，并对两个蛋白之间的相互作用机理进行了探讨；3）利用基于共聚焦和基于全内反射的两种单分子荧光技术对Mad2的折叠过程在单分子水平上进行了系统研究。在上述研究中有以下几个重要的研究结果：1）提出了Mad2折叠过程中存在稳定折叠中间态的理论模型，并指出稳定折叠中间态的存在是导致Mad2两种构象之间转变缓慢的关键因素；2）发现C-Mad2与Cdc20的结合要明显比O-Mad2与Cdc20的结合要强，并指明Mad2与Cdc20之间的相互作用是由疏水作用主导的，而不是通过静电相互作用来实现的；3）利用单分子荧光技术，首次直接捕捉到了Mad2折叠中间态，证实了它的存在，并对该折叠中间态进行了表征，同时发现该折叠中间态是一个必须经过的on-pathway中间态。上述研究加深了我们对于Mad2折叠机理和状态转变过程以及该蛋白与其配体Cdc20相互作用的认识，为建立对这一蛋白功能进行调控的方法奠定了理论基础。研究所得到的结果，特别是首次捕捉到Mad2折叠中间态并实现对其进行表征，对于蛋白质折叠研究具有重要的意义。这种直接对中间态的捕捉解答了蛋白质折叠研究中一直难以解决的关于中间态是否真实存在的争议，为蛋白质折叠研究提供了新的证据和新的思路。