FHL1-RGS2-DDB1E3连接酶信号通路在口腔鳞癌发生、进展中作用机制研究

To clarify to the pathogenesis of tumor and improve tumor therapy depends on deeply functional mechanistic study and screening and validating of pathway-related targets involved in oral squamous cell carcinoma (OSCC) initiation and progression. Focusing on a novel tumor suppressor gene FHL1 which was validated in previous study, the project further revealed FHL1 interacts with Regulator of G-protein signaling 2(RGS2) by yeast two hybrid assay and co-immunoprecipitation platform. This project focuses on the functional and mechanistic study of RGS2 in OSCC. To evaluate the expression and clinical implications of RGS2 in HNSCC by utilizing TCGA database and OSCC tissue bank; To reveal the function of RGS2 in OSCC cell lines by using lentiviral vector system and CRISPR/Cas9 technique cytologically; To identify RGS2 as a driver gene in OSCC initiation and progression by applying RGS2 knockout model with chemical agent-induced oral cancer. To reveal the mutual regulation mechnism of FHL1-RGS2-RGS2 ubiquitination protein DDB1 E3 ligase in molecular level. The findings provide FHL1-RGS2-DDB1 E3 ligase complex pathway as novel therapeutic targets for OSCC. The results possess the important theoretical significance and potential application value.

肿瘤发病机制的阐明和治疗不断完善，有赖于对肿瘤发生进展相关信号通路特定靶点的筛选和验证。本项目聚焦申请人前期鉴定新的头颈鳞癌候选抑癌基因FHL1，利用酵母双杂交和免疫共沉淀等技术，初步筛选确定FHL1新的作用蛋白RGS2。重点对RGS2进行深入的功能及机制研究。利用TCGA数据库和口腔癌组织库评价RGS2表达及临床意义；细胞学水平应用慢病毒系统和CRISPR/Cas9技术揭示RGS2基因的功能；动物模型水平应用RGS2基因敲除小鼠，结合化学致癌剂诱导口腔癌实验研究RGS2基因在口腔鳞癌发生发展中发挥的关键作用；分子水平深入揭示FHL1-RGS2-RGS2泛素化E3连接酶相关蛋白DDB1之间相互作用及在口腔癌发生中分子机制；研究结果能为FHL1-RGS2-DDB1E3连接酶信号通路分子作为口腔鳞癌治疗新的靶点提供依据，具有重要理论意义和潜在应用价值

G蛋白信号通路在一系列恶性肿瘤包括头颈部鳞癌中可以直接激活EGFR或 EGFR非依赖性信号通路促进肿瘤的发生、发展。目前有关G蛋白信号调节因子2（regulator of G -protein signaling 2，RGS2）在肿瘤进展中的具体作用和机制尚无定论。本项目探讨RGS2对口腔鳞癌细胞增殖、侵袭的影响及示FHL1-RGS2-RGS2泛素化E3连接酶相关蛋白DDB1之间相互作用调控机制。基于TCGA数据库分析RGS2在头颈鳞癌中表达情况及其临床病理相关性；Lentiv-RGS2过表达稳定转染口腔鳞癌细胞系（SCC-9，Cal-27， Fadu），Transwell侵袭实验、平板克隆实验、CCK-8生长曲线实验，检测RGS2对细胞侵袭、增殖的影响；酵母双杂交技术、免疫共沉淀技术检测RGS2与抑癌基因FHL1、泛素化相关蛋白DDB1的相关性。本研究发现RGS2 mRNA在口腔鳞癌组织中表达显著低于其在癌旁组织中表达，且RGS2 mRNA高表达患者肿瘤病理淋巴血管侵犯显著减少（P<0.001），在有淋巴结转移的头颈鳞癌患者亚群中，RGS2 mRNA 高表达的患者具有更好的总生存率（Log rank P=0.023）;同时，我们细胞学研究也发现高表达RGS2能显著抑制口腔鳞癌细胞的侵袭、增殖能力。这均提示RGS2在口腔鳞癌中发挥抑癌的作用。本研究首次发现X染色体相关基因 FHL1可与DDB1竞争性结合RGS2，从而通过泛素化-蛋白酶体途径影响RGS2蛋白的稳定性。综上，通过本项目研究阐明了RGS2在口腔癌发生发展中的抑制作用，高表达RGS2蛋白可抑制口腔鳞癌细胞的增殖、侵袭。进一步发现抑癌基因FHL1可与E3连接酶复合体竞争性结合RGS2，阻滞RGS2的泛素化进程，维持RGS2蛋白的稳定。这将为后续进一步探索以联合靶向RGS2和FHL1作为口腔鳞癌临床治疗靶点的研究提供临床参考意见。本项目的理论成果：1)初步阐明RGS2 基因在口腔颌面部头颈鳞癌发生、发展中发挥的关键作用；2)初步揭示FHL1-RGS2-DDB1 三种蛋白之间相互作用及调控分子机制；