组蛋白甲基转移酶EZH2介导的FHL1基因表观遗传学沉默在口腔鳞癌发生中作用和机制研究

Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is widely represented as a heterogeneous tumor with more aggressive phenotype. It was reported that molecular signature alterations based on epigenetic modifications play a critical role in oral squamous cell carcinoma (OSCC) initiation and progression. In the previous study, we showed that up-regualtion of the Polycomb complex histone methytransferase EZH2 is critical to maintain the malignant phenotypes in OSCC and associated significantly with oral squamous cell carcinoma development in patients with oral precancerous tissue-oral leukoplakia(OLP). In order to identify a specific molecular network in which EZH2 involved and the tumor suppressor gene silencing mediated directly by EZH2 in oral squamous cell carcinoma, our group firstly predicts FHL1 gene is a putative and candidate target gene of EZH2 by bioinformatics approach; Then through performing a lot of molecular biology and biochemistry's skills, we reasonably show that FHL1 is a direct target gene of EZH2; Eventually, FHL1 will be identified as a key functional gene in OSCC initiation by FHL1 exogenous overexpression and knock down . The results of this project will provide the possibilty of FHL1 as a novel cadidate tumor suppressor gene in OSCC and provide the rationale of FHL1 as a novel diagnostic, therapeutic target in OSCC. Take togather, the project has important theoretical significance and potential application value.

口腔鳞癌代表了一类恶性程度高、具有异质性特点的实体肿瘤。研究已经表明表观遗传学修饰介导的分子表达谱的改变在口腔鳞癌发生、发展中发挥着重要作用。前期实验结果发现，异常高表达的组蛋白甲基转移酶EZH2与口腔鳞癌恶性表型的维持以及口腔癌前病变-白斑的恶性转化密切相关。为了进一步阐明EZH2在口腔颌面头颈鳞癌发生中所涉及的具体分子网络以及其直接靶向的抑癌基因，申请者首先通过使用生物信息学手段，预测FHL1基因是EZH2一个潜在候选的靶基因；接下来通过使用多种分子生物学及生物化学技术，更加合理地证实FHL1基因是EZH2蛋白直接的作用靶点；最后应用基因转导和RNA干扰技术确定FHL1基因在口腔颌面头颈鳞癌发生中发挥的关键作用。研究结果能明确FHL1作为口腔颌面头颈鳞癌新的候选抑癌基因的可能性，为FHL1基因作为口腔颌面头颈鳞癌新的诊断、治疗的靶点提供实验依据和理论基础，具有重要理论意义和潜在应用价值

整个课题以寻找口腔鳞癌潜在新的抑癌基因为目的，通过整合四个代表性公开表达谱芯片数据(GSE2379，GSE3524，GSE6631和GSE13601)，分析并筛选出X-染色体上新的抑癌相关基因FHL1；其转录水平在上述四个公开表达谱芯片的口腔鳞癌组织标本中都显著下调（P < 0.001）；临床数据回顾性分析发现，高表达FHL1的患者比低表达FHL1的患者具有更好的总生存率（Log rank P = 0.018）和无病生存率（Log rank P = 0.038）；在验证组中，也发现FHL1蛋白表达与口腔鳞癌病理分级密切相关（P < 0.05），其高表达组患者比低表达组患者具有更好的总生存率（Log rank P = 0.004）和无病生存率（Log rank P = 0.005），提示FHL1是口腔鳞癌患者新的可靠的预后标志物。进一步基因功能实验提示在高表达FHL1的细胞系中敲除FHL1能明显促进口腔鳞癌细胞系HN-4和SCC-25的增殖，克隆形成（P < 0.001）；在低表达FHL1的细胞系中重新表达FHL1能明显抑制口腔鳞癌细胞系HN-13和CAL-27的增殖，克隆形成（P < 0.001），促进细胞凋亡和HN-13，CAL-27抑制瘤的生长（P < 0.05）。功能性潜在分子机制的研究表明，在低表达FHL1的细胞系HN-13和CAL-27中重新表达FHL1能明显降低CyclinD1和CyclinE表达，同时提高p27的表达；反之，在高表达FHL1的细胞系SCC-25中敲除FHL1的表达能明显提高CyclinD1和CyclinE表达，同时降低p27的表达，提示FHL1功能可能涉及到肿瘤细胞的细胞周期调控。另一方面，表达下调潜在分子机制研究表明，FHL1基因启动子区DNA高甲基化是FHL1在口腔鳞癌组织和细胞中表达下调的主要原因；此外，EZH2和H3K27me3募集到FHL1的启动子区（组蛋白甲基化）也是其在口腔鳞癌中表达下调的主要原因之一；通过本课题研究，丰富了FHL1在口腔鳞癌中的功能作用，研究结果证实FHL1基因是口腔鳞癌潜在新的抑癌基因，其在口腔鳞癌药物或基因治疗中可以作为一个重要靶点，其表达水平对于判断口腔鳞癌患者临床预后具有重要的临床参考意义。