高效瘤胃棉酚降解菌选育鉴定及降解棉酚的基因发掘与功能验证

利用瘤胃外微生物发酵棉粕降低游离棉酚含量近年来倍受关注，但瘤胃内微生物降低游离棉酚含量的研究很少，其降解游离棉酚的途径、相关基因及其机理等仍不清楚。申报者从瘤胃中筛选到一株兼性厌氧棉酚降解菌，试验首先拟利用16S rDNA序列分析方法对该瘤胃棉酚降解菌进行分类鉴；再以高效瘤胃棉酚降解菌外源接种发酵棉粕调控技术初步设想为基础，拟利用离子注入技术选育高效瘤胃棉酚降解菌，将突变高效棉酚降解菌接入到棉粕进行发酵，探讨不同培养条件对其降解棉酚效果影响，旨在明确该菌发酵棉粕降解棉酚的生产技术与工艺；拟利用探针技术发掘该菌降解棉酚相关基因并采用Pk18mobSacB构建标靶基因缺失突变株，在该菌上对可能获得目标基因进行敲除，以验证该基因功能，对进一步利用DNA重组技术改造瘤胃棉酚降解菌具有重要理论意义。

从牛瘤胃中分离获得1 株对棉酚具有降解作用的细菌，经形态学及分子生物学鉴定，确定该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus subtilis)，与Bacillus subtilis subsp. subtilis strain DSM 10同源性98%，命名为棉酚降解菌RBS。应用稀释涂平板法和间苯三酚法初步研究了降解菌的生物量与降解量的关系。对数期的降解率较高，该菌的降解率达85.25%。发酵试验表明发酵前棉粕中游离棉酚的含量为7.0897ug/ml，经RBS菌发酵后游离棉酚含量为2.0127 ug/ml，棉粕发酵后游离棉酚比发酵前降低71.61%，发酵前棉粕中总棉酚的含量为75.7406ug/ml，经RBS菌发酵后总棉酚含量为38.6294 ug/ml，棉粕发酵后游离棉酚比发酵前降低49.99%。发酵棉籽粕的肉鸭饲喂试验表明，发酵后的棉粕可以显著提高肉鸭的生长性能。对棉酚降解菌RBS进行全基因组测序，共预测得编码基因4256个。利用KEGG分析结果发现，在RBS基因组中存在奈降解基因和多环芳香烃降解降解基因等代谢相关的基因。构建了ADH基因的缺失突变株△ADH，该基因的突变大大降低了棉酚降解菌RBS对棉酚的降解能力。使用454-焦磷酸测序技术评估棉酚对瘤胃细菌多样性的影响，棉酚的饲喂显著提高了瘤胃Bacteroidetes和Firmicutes类微生物的多样性，这暗示这两类微生物可能参与了棉粕的降解。