低温诱导的小麦无选择标记基因遗传转化体系建立

植物遗传转化中，选择标记基因起着非常重要的作用。随着越来越多的转基因植物进人环境释放或商品化种植，选择标记基因的食品安全性和生物安全性问题也日益突出。位点特异性重组由于其删除的精确性和较高的重组频率，在选择标记基因剔除方面体现出越来越多的优势。本项目拟在已建立的小麦遗传转化体系基础上，利用已克隆的小麦低温诱导的wcs120启动子，分别构建Cre/Loxp和ParA/MRS重组系统的诱导性删除植物表达载体，利用基因枪和农杆菌转化小麦幼胚愈伤组织，不同低温处理诱导删除选择标记基因，通过载体改造和诱导条件摸索，提高删除效率和稳定性，建立小麦的无标记基因转化体系。利用该体系对与小麦低温胁迫相关的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因进行转化，研究该基因在低温胁迫中的功能，为转基因小麦商品化和小麦遗传改良奠定基础。

选择标记基因在植物遗传转化中起着非常重要的作用，其生物安全性和食品安全性问题也是转基因作物商品化种植的限制因素。因此，遗传转化后选择标记基因的删除成为作物基因工程改良的关键。本研究从小麦西农928中克隆了低温诱导的wcs120 启动子，构建了低温诱导删除的CinH/RS2和ParA/MRS单向位点特异性重组植物表达载体，并对小麦绵阳19幼胚愈伤组织进行了转化，经过筛选和再生，阳性植株春化后初步检测到了标记基因的删除；克隆了拟南芥热激蛋白hsp18.2基因启动子，构建了热诱导删除的CinH/RS2系统植物表达载体，基因枪转化筛选后阳性植株后代大田种植，两个转基因株系表现出耐旱性；用PYL5基因和bar基因共转化西农889、绵阳19和宁春16幼胚愈伤组织，经过筛选分化和PCR检测，15株bar基因阳性植株中有7株PYL5基因阳性；以单拷贝Pinb基因为内参基因，分别以6个转Loxi 基因的TF5株系基因组DNA为模板，采用Taqman定量PCR技术，对转基因小麦外源基因拷贝数进行了测定，初步建立了转基因小麦后代外源基因拷贝数的测定方法。本研究为小麦遗传转化中选择标记基因删除提供了一个新的方法，为小麦无标记转化和遗传改良奠定基础。