参与油脂合成的三个油菜长链脂酰辅酶A 合成酶基因（BnLACS)的功能鉴定

Oil rape is an important crop which supply the edible oil, industrial and biofuel provision. Understanding the mechanism and network of lipid synthesis is critical for improving the oil contents of oil rape. Long chain acyl CoA synthetase (LACS) catalyzes free fatty acids to form fatty acyl CoA, which is the substrate of fatty acid modification and lipid synthesis. We previously cloned 3 LACSs from Brassica napus and confirmed that they involved in lipid biosynthesis pathway, furthermore, one BnLACS resided at the chloroplast which is the site of fatty acid de novo synthesis, and other two LACSs resided in the ER (endoplasmic reticulum). In this project, the three BnLACSs will overexpress simultaneously in tobacco leaves and oil rape. In the meantime, the three BnLACSs will overexpress and RNAi express respectively in oil rape. In the transgenic plants, the acyl CoA, fatty acids and lipid in the treated tobacco leaves and oil rape will be analyzed, as well as the wax and cutin in the oil rape leaves which is related to the disease resistance. And then the transcriptome among the overexpression, RNAi and wild type oil rape will analyse. The sequences and their function of 3 locus in the oil rape germplasm with different oil content will analyze. The all above analysis will unravel the function of 3 LACSs or the acyl CoA pool in chloroplast and in ER to the fatty acid and lipid biosynthesis and dissect the regulation network in lipid synthesis. With the sequence difference among the different oil content material of 3 locus, we also design the new molecular marker of higher oil content.

油菜是重要的油料作物，提供食用油，也是重要的生物能源和工业原料。研究油脂合成基因调控的网络对提高油菜含油量具有重要意义。脂酰辅酶A合成酶（LACS）催化游离脂肪酸成为油脂合成的底物脂酰辅酶A。我们前期已经证明3个油菜LACS参与了油脂的代谢，并且定位于脂肪酸从头合成的场所叶绿体和油脂装配的场所内质网。通过在烟草同时瞬时表达和油菜中同时过量表达三个基因，在油菜中分别过量和抑制表达这三个基因，分析烟草和油菜种子油脂的生化组分的变化以及可能引起的叶片表面角质和蜡质的差异进而引起抗病性的变化；分析过量表达，抑制表达以及野生型转录本；分析不同含油量油菜这3个基因的在种子发育期表达水平以及这3个位点的序列变化及序列功能差异。从而阐明3个BnLACS或细胞质，内质网脂酰辅酶A的水平在油脂合成途径中的作用，解析油脂代谢网络调控的机制，根据不同含油量油菜三个位点的序列和功能的差异，设计出新高含量分子标记。

油菜是重要的油料作物，同时也是重要的生物能源原料。在中国，油菜生产远不能满足需求。因此研究和油菜油脂合成以及产量相关基因的功能有重要的意义。本研究从催化产生油脂合成的底物脂酰辅酶A入手，研究了三个脂酰辅酶A合成酶的功能。从油菜的基因组中分离出三个脂酰辅酶A合成酶基因BnLACS1, BnLACS2和BnLACS9基因，序列的分析表明，它们都具有AMP的结合功能域，酵母互补实验证明了这三个BnLACS都能互补LACS缺陷的酵母突变体，表明三个BnLACS都具有活性。在酵母中异源表达这三个BnLACS表明，异源表达BnLACS1和BnLACS2能提高酵母细胞中的油脂含量，而BnLACS9不能提高油脂的含量。在烟草和油菜的瞬时表达实验表明，BnLACS1和BnLACS2定位于细胞的内质网膜系统中，也就是油脂合成的场所，而BnLACS9则定位于叶绿体的外膜中，这是脂肪酸从头合成部位。三个基因在油菜种子发育时期都有表达。在发育的早、中期（35DAP）三个基因在高含油量的品种表达量都高于低含油量的品种，BnLACS1和 BnLACS2在整个种子发育期，高含油量的品种都比低含油量品种高。在烟草瞬时表达三个基因，都能提高BnLACS的催化产物脂肪酰CoA的含量，同时也能提高叶片中糖脂的含量。BnLACS9还能提高叶片叶绿素的含量。进一步在油菜中过量表达这三个基因，转化株后代都能提高种子的含油量，表明这三个基因都参与到了油脂的生物合成途径中。对于BnLACS9的进一步分析表明过量表达BnLACS9,能提高油菜叶片叶绿素的含量，因而也提高了叶片的光合作用效率，增加了叶片的干物质积累。透射电镜分析表明，过量表达BnLACS9,增加了类囊体片层数，而叶绿素的合成和光合作用就在类囊体中进行。转录组结合定量PCR分析表明，过量表达BnLACS9,能提高叶绿素合成途径的关键酶基因的表达，同时也提高了脂肪酸从头合成途径，油脂合成途径中关键酶的表达，因而提高了种子的含油量。因此，我们的结论是，过量表达三个BnLACS基因都上调油菜种子油脂的合成途径的基因，BnLACS9还参与了叶片的叶绿素合成途径。三个基因都能作为提高油菜含油量和产量的靶标基因应用于育种实践。