B超引导下胚胎内显微注射技术快速建立口腔鳞状细胞癌小鼠研究模型

Oral cancer is the 6th most common cancer worldwide, in which 90% of the histopathologic diagnosis is squamous cell carcinoma. The five-year survival is about 50% during the past forty years, although the comprehensive treatment with surgery and chemo-radio therapy is put into widely application. It is still one of the deadly diseases which threatened the public health. Animal model is not only the important methodology and approach for cancer research, but also the premise for rapid development of medical biology. Setting up of an efficient and matching animal model makes it possible to explore the initiating, development of cancer and further the research on therapy and prevention. This project will take advantage of RNA interference technique to silence the cancer suppressor gene with ultrasound guided in utero microinjection to mice. It can tissue-specified target the epidermis system with candidate genes, which is a way to find out their effects on skin and oral mucous epithelial cell growth during development and tumorigenesis. This breaking-through technology has the advantages of shorten research period, high efficiency, simple equipment requirement, affordable cost and broadly application fields when compared with the conventional procedures of transgenic mouse. It brings the possibility to screening a large scale candidate genes pool in a considerable short period of time. This makes a great platform for oral cancer research in the future.

口腔癌在所有恶性肿瘤中发病率居第6位，其中90%的病理类型是鳞状细胞癌。在过去的四十年，尽管手术、放化疗的综合治疗得到推广，口腔癌的五年生存率一直徘徊在50%左右，没有明显的改善，成为严重威胁人类健康的疾病之一。实验动物模型是研究人类恶性肿瘤的重要方法和途径，也是医学生物学得以迅速发展的重要前提之一。建立一个高效、吻合度高的动物模型，使人类能够对于肿瘤的发生、发展和治疗及预防进行深入的研究和探讨。本课题拟在B超引导下进行小鼠胚胎内显微注射，将候选基因组织特异性引入胚胎上皮系统，利用RNA干扰技术，沉默抑癌基因或与细胞增殖、分化相关基因，从而观察其在小鼠皮肤及口腔黏膜上皮细胞生长发育和肿瘤形成中的作用机制。较之传统的转基因小鼠生产及制作方式，此方法具有周期短、效率高，设备简单、费用低，而且适用范围广的优势。可以完成在短期内大量候选基因的筛选工作，为口腔癌的基础研究提供了非常便利的平台。

口腔癌是口腔颌面部常见的恶性肿瘤，其中90%口腔癌的病理类型是鳞癌。尽管口腔肿瘤的治疗和修复手段在近些年有了很大的发展，但口腔鳞癌的五年生存率一直徘徊在60%左右，没有明显的改善。实验动物模型是研究人类恶性肿瘤的重要方法和途径，也是医学生物学得以迅速发展的重要前提之一。建立一个高效、吻合度高的动物模型，使人类能够对于肿瘤的发生、发展和治疗及预防进行深入的研究和探讨。本课题根据口腔癌发生的两大主要因素：生物因素（病毒感染）和化学因素（致癌剂），分别构建了两种口腔癌发生模型。病毒感染导致的口腔癌模型是利用B超引导下进行小鼠胚胎内显微注射技术，将筛选出来的候选基因（siSRPK1病毒、siDCS2病毒、siEIFB5病毒、siP53病毒、siPTEN病毒、Mettl3过表达病毒、和Rad51过表达病毒、以及多种miRNAs正义和反义构成miRs sponge病毒）组织特异性引入不同遗传背景（野生型小鼠、K14-cre P53 KO小鼠、K14-cre PTEN KO小鼠、K14-cre P53 R270H小鼠和K14-cre Kras 突变小鼠）的小鼠胚胎原始口腔部位，结果发现利用Beronja的方法可以造成口腔组织增生癌变。候选基因与小鼠遗传背景造成的癌症易感性之间的关系还需在进一步深入研究才能确定。除了B超引导下进行小鼠胚胎内显微注射病毒技术建立口腔鳞癌模型外，我们还研究了如何改进经典化学致癌剂DMBA建立口腔癌模型，并利用此技术建立了一株仓鼠口腔癌的细胞系，结果证实DMBA刺激引起口腔癌不需要长期的刺激，15次局部刺激就可以产生致癌的效果，但需要给予较长的时间形成肿瘤。由此我们推出，只要DMBA可以刺激到上皮基底层细胞，或许单次足够剂量就可以产生癌变。但突变的上皮基底细胞需要在特定条件下才能产生肿瘤。这是我们的推测，还需要实验数据加以验证。另外，我们建立的仓鼠细胞系在仓鼠体内具有形成肿瘤的能力。随后通过对临床口腔癌组织、小鼠及仓鼠口腔癌病理组织的高通量、免疫组化、real-time PCR、western blot、RIP、 meRIP-seq等一系列研究分析，发现m6A RNA甲基化基因在口腔癌的发生发展中其非常重要的作用，并进一步证实Mettl3 在口腔癌发生发展的作用及分子机制。本研究对探讨口腔癌模型建立及发生发展具有重要指导意义。