口腔鳞癌淋巴转移模型的建立及VEGF-C/D与口腔鳞癌淋巴转移相关性研究

Owing to the lack of lymphatic metastasis model of oral squamous cell carcinoma (OSCC) in the whole world, little is known about the underlying mechanism related to lymphatic metastasis of OSCC. GDC185-1 is a lymphatic metastatic OSCC cell line derived from submandible lymph node in nude mice that had been inoculated by GDC185 cells in the tongue in our lab. In this proposal, we are planing to establish new lymphatic metastasis OSCC cell lines by using Tca-83 and Cal-27 OSCC cell lines through tongue inoculation-submandible lymph nodes screening methods. We will take the lymphatic metastasis OSCC cell line pair, GDC185 and GDC185-1, and others that will be established as our models to investigate the uderlying mechanism of OSCC lymphatic metastasis by using wound healing assay, Transwell invasion assay, Real time PCR, Westrn blot, immunostaining, animal experiments via cell inoculation in the tongue tissue-submandible lymph nodes screening methods. The underlying mechanism will be focused on the roles of VEGF-C/VEGF-D in the process of OSCC lymphatic metastasis through the methods described above as well as highthrough approches such as digital gene expression.

由于在世界范围内缺少口腔鳞癌淋巴转移模型，导致人们对口腔颌面部鳞癌淋巴转移机制所知甚少。本课题组已建立了一对口腔鳞癌淋巴转移细胞系（GDC185和GDC185-1），拟以此为主，再选取Tca-83和Cal-27口腔鳞癌细胞系，即裸鼠舌部接种后，再从颌下转移淋巴结中培养出淋巴高转移细胞系，为研究口腔鳞癌淋巴转移机制提供研究基础。在研究口腔鳞癌淋巴转移机制方面，我们以GDC185和GDC185-1等口腔鳞癌淋巴高低转移细胞系为研究对象，拟采用划痕、侵袭实验、Real time PCR， Western Blot，免疫组化、细胞口腔原位种植-颌下淋巴结转移动物实验等手段，以VEGF-C和VEGF-D为突破口，同时辅以转录组学等高通量分析技术，研究VEGF-C和VEGF-D在口腔鳞癌淋巴转移中的作用及其调控机制。

研究背景：口腔鳞癌占口腔癌的90%左右，将近30%~45%的口腔鳞癌患者就诊时存在颈淋巴结转移。一旦发生淋巴转移，患者的五年生存率大约下降一半。目前对口腔鳞癌的经淋巴转移机制所知甚少，原因之一是没有可靠的转移模型，因此有必要在这方面做进一步探讨。. 研究目的：建立口腔鳞癌淋巴转移动物模型及细胞模型并初步探讨VEGF-C/D等与口腔鳞癌淋巴转移的相关机制. 材料和方法：将CAL-27、Tca-83和HeLa等三株细胞系种植于裸鼠舌部。40至50天后，取裸鼠颈部淋巴结进行体外培养建系及组织病理学分析。然后，通过CCK-8实验、划痕试验和动物实验比较这两对同源异质细胞系之间的差异。通过免疫组织化学方法，检测MMP-2、MMP-21、VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3在63例临床标本中原发灶和转移灶中的表达情况。使用Wilcoxon配对检验方法评价原发灶和转移灶中目的蛋白表达水平差异，用Kaplan–Meier方法检测原发灶和转移灶中MMP-2、MMP-21、VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3的表达与患者总生存率的关系。. 实验结果概述：CAL-27、Tca-83和HeLa均可用于建立淋巴转移动物模型，CAL-27和Hela细胞可经颈淋巴结培养出新的细胞系，命名为LN-CAL-27和LN-HeLa。CCK-8实验、划痕试验和动物实验均显示LN-CAL-27和LN-HeLa的增殖、迁移和转移能力强于其母细胞系。MMP-21和VEGF-C在转移灶中的表达水平高于原发灶。原发灶中高表达MMP-2和VEGF-C以及转移灶中高表达MMP-2、MMP-21、VEGF-C和VEGF-D的口腔鳞癌伴随淋巴转移患者总生存率低。.实验结论：CAL-27, Tca-83和HeLa可模拟体内肿瘤细胞的淋巴转移过程。此外，同源异质细胞系（CAL-27和LN-CAL-27; HeLa和LN-HeLa）可用于研究淋巴转移机制。同时，结果提示转移灶相关因子表达情况对于预测口腔鳞癌伴随颈淋巴结转移患者的预后更有意义。. 本课题基本达到预期研究成果，即成功建立口腔鳞癌淋巴转移动物模型；初步阐明 VEGF-C 和 VEGF-D 促淋巴转移分子机制；发表 SCI 论文 2 篇；培养研究生 2 人。