丹参-黄芩干预大鼠脊髓损伤后早期炎症反应的作用机制及物质基础研究

In order to clarify the mechanism and material basis of SM-SR’ effect on the early-stage inflammatory reaction of rat spinal cord injury, firstly, Allen’s WD spinal cord contusion model was constructed with rats, and SM-SR was adopted to carry out intervention treatment, then recovery situation of SCI rats during 1 week after SCI was evaluated by Basso Beattie Bresnahan score, and morphological differences of wounded spinal cord area between different groups was compared; Secondly, concentrations of proinflammatory cytokines in wounded spinal cord area and plasma during 36 h after SCI was assayed by ELISA, then concentrations of multi-constituents in Salvia Miltiorrhizae Radix et Rhizoma and Scutellariae Radix was quantified by HPLC-MS/MS; Lastly, PK-PD combined analysis was performed to explore the relationship between proinflammatory cytokines and active constituents. In our research, active constituents in Salvia Miltiorrhizae Radix et Rhizoma and Scutellariae Radix to cure SCI and the key proinflammatory cytokines in early-stage inflammatory reaction was assayed. Our results would provide theoretical support for clinical practice, and explore the effect and mechanism of combination usage of Salvia Miltiorrhizae Radix et Rhizoma and Scutellariae Radix.

为了阐明丹参-黄芩配伍治疗脊髓损伤（SCI）早期炎症反应的作用机制和物质基础，本研究首先建立大鼠Allen’s WD脊髓挫伤模型，采用丹参-黄芩配伍对其进行干预治疗，通过Basso Beattie Bresnahan评分对药物干预后1周内SCI大鼠的恢复情况进行整体行为学评价，对比各组大鼠脊髓损伤的形态学差异；其次，通过酶联免疫吸附法检测SCI后36 h内前炎症细胞因子在脊髓损伤部位和血浆中的含量变化，同时采用液质联用技术检测丹参和黄芩中多指标成分在脊髓损伤部位和血浆中的含量变化；最后，进行药动-药效（PK-PD）联合分析，发掘前炎症细胞因子与药物中活性成分的含量变化之间的相关性。通过该研究可以筛选出丹参-黄芩治疗SCI的主要活性成分以及在SCI后早期炎症反应中发挥关键作用的前炎症细胞因子，为临床应用提供理论支持，对丹参-黄芩伍用治疗SCI的效果及机制进行初步的探索。

本项目选择丹参、黄芩两味中药为研究对象，分别考察两者单独及配伍使用时对脊髓损伤（SCI）大鼠的治疗作用，并探明了药材中主要活性成分在SCI大鼠体内的药代动力学情况。.经过4周的药物干预，BBB评分显示各组的评分均从0分上升至13-15分，显著高于模型组。造模3d后脊髓出现明显血肿、水肿；2w时出现瘢痕和组织增生，有脓肿粘液，脊髓与硬脊膜出现粘连；4w时出现明显瘢痕组织。与模型组相比，各给药组血肿轻、瘢痕面积小，无脓肿粘液，其中丹参的效果最好。HE染色结果显示，造模后脊髓组织结构紊乱，灰、白质组织结构不完整。3 d时可见损伤区周围分散有红色的血迹；2 w时损伤区可见大片坏死灶，大量炎性细胞浸润，神经细胞水肿坏死，形成多个大小不一的空腔；4 w时损伤区形成大面积空洞。给药后，脊髓组织结构紊乱明显改善，空腔体积缩小，炎性细胞浸润及神经细胞水肿现象减轻。.组织免疫荧光和western blot结果显示，脊髓遭受重创后，神经元的主要骨架成分NF-200的蛋白水平显著升高，神经营养因子BDNF的含量则显著下降。给药后，与模型组相比，NF和BDNF水平均显著升高，提示两种药物均能促进神经元功能恢复。而SCI后，星形胶质细胞标志物GFAP和小胶质细胞标志物CD11b均被迅速激活，发挥双重作用。给药后，各组GFAP含量均显著降低，其中配伍组降低最显著，其次是黄芩组，丹参组最差。而CD11b的各组变化则不一致，丹参组CD11b含量上升，黄芩组下降，配伍组则以黄芩的作用占主导。.建立了SCI大鼠血浆中丹参和黄芩中多指标成分的UPLC-MS/MS分析方法，可同时对12种成分的血药浓度进行定量检测，方法专属性好、灵敏度高、分析时间短、准确可靠。各成分达峰时间（Cmax）均在2h以内，所有成分在给药24h后在体内仍可检测到。.综上所述，丹参、黄芩可显著提高SCI大鼠的BBB评分，改善脊髓组织结构紊乱，减少炎性细胞浸润及神经细胞水肿，减小脊髓空洞，促进后肢运动功能恢复。同时，显著增加神经元中的NF-200水平和BDNF含量，降低星形胶质细胞数量，消除瘢痕，清除组织碎片，帮助神经再生。