乙酰天麻素保护糖尿病RGCs损伤的机制研究

Diabetic retinopathy was one of the maincauses leading to blind in the world. However, its morbidity mechanism still remains unclear completely and its treatment effect in clinic is undesirable too. It has been showed that proNGF-p75NTR signal passageway had been envolved in the damage of retinal ganglion cells in diabetes in our previous study. Moreover, our study had demonstrated acetagastrodin, a derivate of tranditional chiness medicine, could protect RGCs effectively aganist injury and apoptosis in diabetes, as well as improve visual electrophysiological abnormal in diabetes patients. The mechanism was related to proNGF-p75NTR signal passageway. Nevetheles, the exact anti-apoptosis and neuro-protective mechanisms are not known completely now. In order to study the neuro-protective mechani-sms of acetagastrodin on visual function in diabetes and to enable its application in clinic, we will set up diabetes model in vivo and vitro to observe the effect of proNGF-p75NTR, a candidate gene, in the protective course of acetagastrodin on RGCs injury at the various level including cells, protein and gene. Meanwhile, we will construct signal passageways network on effective mechanism of acetagastrodin by transcriptomics analysis and animal test verification as a supplement. This study will promot our cognition in morbidity mechanism of early diabetic retinopathy and open up new method to protect visual function effectively in patients with diabetic retinopathy.

糖尿病视网膜病变是全球主要的致盲性眼病之一，其发病机制目前尚不完全清楚，治疗效果也不佳。我们前期研究发现proNGF-p75NTR信号通路参与了糖尿病RGCs的损伤；同时我们发现传统中药衍生物乙酰天麻素能有效保护糖尿病RGCs的损伤和凋亡，并能有效改善糖尿病早期患者视觉电生理的异常，其保护作用可能与proNGF-p75NTR信号通路有关。然而，其具体抗凋亡和神经保护机制并不清楚。为了继续对乙酰天麻素在糖尿病视功能的保护机制进行解析，并为其更好的临床应用提供科学依据，我们将采用糖尿病体内外模型，在细胞、蛋白和基因水平对候选基因proNGF-p75NTR进行研究，同时，我们将利用转录组学分子分析和动物实验验证进行补充，构建乙酰天麻素保护糖尿病RGCs的功能性分子调控网络。这一研究将增进我们对早期糖尿病视网膜神经细胞病变发病机制的认识，并为临床有效保护糖尿病视网膜病变患者的视功能开辟新的方法。

目的：研究乙酰天麻素对糖尿病视网膜神经节细胞(Retinal ganglial cells, RGCs)的保护作用，探索proNGF-p75NTR信号通路及下游信号分子的其中的作用，探讨乙酰天麻素对糖尿病早期可能的神经保护机制。.方法：原代培养大鼠RGCs，实验分为去离子水对照组、高糖 RGCs 模型组以及50 mg•L-1乙酰天麻素干预组。CCK8来检测RGCs 活性，流式细胞术及Cleaved Caspase-3水平检测细胞的凋亡情况，透射电镜观察细胞结构的超微变化，WB、qRT-PCR检测proNGF、p75NTR及下游信号分子表达和活化情况。STZ腹腔注射建立SD糖尿病大鼠模型，检测动物视觉功能和视网膜上相关信号分子的表达情况。.结果：1. CCK8显示糖尿病组细胞存活率明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）；50 mM高糖培养24 h后达到半数致死量。乙酰天麻素能提高细胞在高糖下的存活率。2.透射电镜的结果显示，高糖培养下的细胞内微体以及溶酶体较对照组增加，内质网、线粒体等细胞器数量明显减少，线粒体肿胀、嵴明显减少，高尔基体空泡增多，内质网膨大。乙酰天麻素干预能减轻细胞的这种变化。3.流式细胞术结果显示：高糖模型组细胞凋亡现象较对照组明显增加，乙酰天麻素改善了高血糖引起的细胞凋亡。4.WB结果显示模型组 RGCs 的Cleaved Caspase-3 表达较对照组的增加。给予乙酰天麻素干预后，高糖介导的 RGCs 上的Cleaved Caspase-3 表达减少，差异有统计学意义（P<0.05）。5.电生理实验显示：乙酰天麻素能改善糖尿病引起的视觉功能降低。6. WB和qRT-PCR的结果分别显示体外模型组RGCs 中的proNGF、p75NTR蛋白及mRNA表达增加，其下游信号分子PI3K和C-JUN磷酸化活化增加。乙酰天麻素干预后，上述信号分子在RGCs中的蛋白和mRNA表达明显减少，相对密度分析，差异均有统计学意义（P<0.05）。乙酰天麻素同样能抑制动物模型视网膜上高糖介导产生proNGF、p75NTR、P-PI3K和P-C-JUN蛋白的表达。.结论：乙酰天麻素能有效保护糖尿病RGCs的凋亡和损伤，其机制与抑制proNGF-p75NTR/P-C-JUN/P-PI3K有关。因此，该通路有可能是乙酰天麻素保护糖尿病视网膜神经细胞病变的关键信号通路。