四跨膜膜蛋白在病毒入侵中的作用机制和抗病毒靶标研究

Emerging viruses pose an increasing global threat in the context of progressing globalization and climate changes also because effective antivirals are missing. Development of effective treatment strategies against individual viral infections are cost intensive and hampered by viral resistance. Broadly acting antiviral strategies are virtually absent. Targeting host entry factorsis highly attractive to prevent resistance. Indeed, during different Hepatitis C virus studies, we and other provided proof-of-concept that targeting a host entry factor results incure of chronic infection in vivo. Since viruses sharecommon pathways of penetrating the host cells, targeting critical steps of these processes holdgreat promise to block infection of multiple viruses that rely on the same cellular bottlenecksfor entry. Using proteomic analysis, RNAi and viral pseudoparticles, we identified cell membrane proteins of tetraspanin-enriched microdomains (TEM)as broad cell entry factors for pathogens of six virus families. These include, among others, mosquito transmited viruses and also highly pathogenic Ebola virus and Lassa virus. In furtherconfirmatory studies using human cell lines, RNAi and infectious live viruses, we validated a panel of 4 TEM proteins that are essential for entry of multiple viruses and candidatetargets for broadly acting antivirals. In the frame of this application, we will (i) validate the importance of the identified TEM proteins for broad viral entry inprimary human cells, (ii) reveal the mechanistic role of the identified TEM proteins for the virusentry pathway, (iii) characterize the impact of virus entry on TEM rearrangement and signaltransduction, and (iv) develop a new generation of broadly acting antivirals based on hosttargetingantibodies and small molecules interfering with virus –TEM protein interactions. Theexpected results, targets and compounds of this project will advance the current understandingof membrane biology, unravel novel treatment strategies against viral infections and enforcethe first line of defense against emerging viral threats that use similar entry pathways.

在全球化和气候变化的背景下，新发病毒日益增长，造成全球威胁，亟待有效的抗病毒药物。目前，仍然缺少广谱抗病毒策略来阻止未知的、新发的、尚无药物的病毒。病毒感染的第一步是病毒入侵，申请人已发表的成果证明靶向病毒入侵所需的宿主因子，可以有效阻止丙型肝炎病毒的慢性感染。虽然不同病毒的细胞受体各有不同，但很多病毒都共享黏附和穿透宿主细胞膜的途径，靶向这一过程中的关键膜蛋白可以阻止多种病毒的感染。我们鉴定到很多富含四跨膜区(TEM)的膜蛋白，可作为六种不同病毒科病毒的广泛入侵因子。这些病毒包括虫媒病毒及高致病性埃博拉和拉沙病毒。我们将（i）验证所鉴定的TEM蛋白在人类原代细胞中对病毒入侵的广谱性作用，（ii）揭示所鉴定的TEM蛋白介导病毒入侵的机理作用，（iii）描述病毒入侵对TEM蛋白重排和信号转导的影响，（iv）通过阻断病毒-TEM蛋白相互作用开发新一代广谱抗病毒小分子或中和性抗体。

在不断发展的全球化和气候变化的背景下，新出现的病毒构成了越来越大的全球威胁，这也是因为缺少有效的抗病毒药物。针对个别病毒感染的有效治疗策略的开发是成本密集型的，并受到病毒抗性的阻碍。广泛作用的抗病毒策略几乎不存在。瞄准宿主的进入因素对防止抗药性是非常有吸引力的。由于病毒有共同的穿透宿主细胞的途径，针对这些过程中的关键步骤，有很大希望阻止依赖相同细胞瓶颈进入的多种病毒的感染。利用蛋白质组学分析、RNAi和病毒假颗粒，我们确定了四种富含微域（TEM）的几种细胞膜蛋白是六个病毒家族的病原体的广泛细胞进入因子。我们的第一个目标是利用CRISPR/Cas9技术的KO细胞来确认它们的重要性。在2019年的第一年，我们产生了肝脏Huh7.5.1和肺部A549 KO细胞系，因为这些细胞被用于我们的siRNA筛选，我们描述了蛋白质表达的消耗，以选择最佳克隆。在CDK2、CD46、TSPAN15和TM9SF2中，只有消耗TM9SF2能够抑制CHIKV进入。2020年COVID-19爆发后，我们开发了携带Spike包膜蛋白的冠状病毒假颗粒（SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS）。使用我们的CRISPR/Cas9工具，我们产生了Hela-ACE2和CALU 3-ACE2细胞的敲除（CDK2、CD46、TSPAN15和TM9SF2）。这些因素都没有抑制任何冠状病毒的假型。然而，我们研究了病毒的进入机制，并分离出对SARS-CoV-2变种具有广泛活性的人类单克隆抗体和纳米抗体。利用我们在病毒进入方面的技能，我们精确地描述了它们的作用方式，我们表明预防性注射可以保护仓鼠免受SARS-CoV-2的感染。最后，为了确定宿主因素，我们同时使用不同的黄病毒和阿尔法病毒启动了全基因组CRISPR/Cas9筛选。由于上海的情况复杂，工作进展缓慢，我们没有时间达到确定细胞靶点和开发具有宿主导向的广谱抗病毒的目标。