固定蛋白酶的无机杂化纳米花的构筑及其在蛋白质组学中的应用研究

Protein enzymatic digestion is an essential step in proteomics and it is significant to study efficient immobilized enzyme carriers for the development of proteomics. Enzyme-inorganic hybrid nanoflower is a new type of immobilized enzyme carrier. However, how to stably construct nanoflowers with high biological activity and achieve efficient enzymatic hydrolysis of protein samples remains a challenge. In this project, based on the hard and soft acid and base theory, a series of inorganic hybrid nanoflowers immobilized with trypsin and endoproteinase Lys-C were constructed by using the interaction between enzymes and metal ions with different softness and hardness. The effects of metal ion types and concentrations on the microstructures of nanoflowers were systematically investigated to explore the interaction between organic and inorganic components in nanoflowers, which guarantee the efficient enzymatic ability of protease-inorganic hybrid nanoflowers in proteomics. The nanoflowers can effectively improve the biological properties of protease and realize the dual recycling of enzyme and carriers, thereby reducing the cost of immobilized enzymes and environmental pollution. Using protease-inorganic hybrid nanoflowers, single enzyme digestion, double enzyme sequential enzyme digestion and double enzyme co-digestion were adopted to digest protein samples and the whole protein of cancer cells. A new universal method for rapid and efficient enzymatic hydrolysis of proteins was proposed, which provided theoretical basis for the application of enzyme-inorganic hybrid nanoflowers in proteomics.

蛋白质酶解是蛋白质组学中的关键步骤，研究高效固定化酶载体对蛋白质组学的发展有重要意义。酶-无机杂化纳米花是一种新型的固定化酶载体材料，但如何稳定地构筑具有高生物活性的纳米花，并实现其对蛋白质样品的高效酶解仍是一个挑战。本项目基于软硬酸碱理论，利用酶与软硬程度不同的金属离子间相互作用，拟构筑一系列固定胰蛋白酶和赖氨酰基内切酶的无机杂化纳米花，系统研究金属离子类型和浓度对纳米花微观结构的影响，探索纳米花中有机与无机组分间的相互作用，保障蛋白酶-无机杂化纳米花在蛋白质组学中的高效酶解能力。纳米花能有效地提高蛋白酶的生物性能，实现无机盐载体的回收再利用，降低固定化酶成本和对环境的污染。利用蛋白酶-无机杂化纳米花，采取单一酶切、双酶顺序酶切和双酶共同酶切三种方案，对蛋白质样品和癌细胞全蛋白进行消化，提出一种普适性的蛋白质快速、高效酶解新方法，为酶-无机杂化纳米花在蛋白质组学中的应用提供理论基础。

在蛋白质组学中，实现蛋白质高效酶解是至关重要的一步，利用固定化酶技术有利于蛋白质酶解效率的提高。酶-无机杂化纳米花是一种新型的固定化酶载体材料，但纳米花内部有机与无机组分间的作用仍不明晰，不利于稳定地构筑具有高生物活性的纳米花，会影响其对蛋白质样品的酶解效果。本项目选用CuSO4、CaCl2、(CH3COO)2Zn、MnSO4、FeSO4、CoCl2、MgCl2、AgNO3和Fe2(SO4)3作为无机盐组分，利用胰蛋白酶（Trypsin）、赖氨酰基内切酶Lys-C和蛋白内切酶Glu-C三种蛋白酶，分别构筑一系列固定Trypsin、Lys-C和Glu-C的无机杂化纳米花。表征测试结果表明纳米花的形成主要是基于蛋白酶中氨基和羧基与金属离子间的相互作用，且金属离子的电荷和大小对纳米花的形貌结构有显著影响。选择N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）为胰蛋白酶活性测试底物，酪蛋白为Lys-C和Glu-C活性测试底物，研究了纳米花中蛋白酶的生物活性、稳定性及重复使用能力，在蛋白质组学中以蛋白酶的生物活性为首要考虑指标，筛选出蛋白酶性能最佳的杂化纳米花主要是以Cu2+和Zn2+为无机组分的纳米花。利用蛋白酶-无机杂化纳米花，采取单一酶切、双酶顺序酶切和双酶共同酶切三种方案，对牛血清白蛋白和辣根过氧化物酶进行消化酶解。结果表明使用胰蛋白酶纳米花时酶切时间短，酶切效果优于天然胰蛋白酶，最佳酶切方案是双酶顺序酶切中Trypsin纳米花与Lys-C纳米花质量比是2:1时的酶切方案，从而提出了一种蛋白质快速、高效酶解方法，为蛋白酶-无机杂化纳米花在蛋白质组学中的应用提供理论基础。