壳聚糖纳米球介导TGF-β1siRNA靶向干预肝内肿瘤微环境抑制结直肠癌肝转移的作用及机制研究

We propose this idea of hepatic targeting TGF-β1siRNA/chitosan nanoparticle to prevent CRC liver metastases based on our previous findings of TGF-β1 inhibiting differentiation of cancer cell （Cancer Sci, 2010）and IL-12 /chitosan nanoparticle prevent CRC liver metastases in mice（Biomaterials, 2012）. The pre-experiment results show that the TGF-β1siRNA/chitosan nanoparticle can prevent CRC liver metastases by interfering expression of Ras and ERK，the key proteins of MAPK signaling pathway in liver. Here, we will aim to study the relationship between protocols such as liver-targeting enhancement and pH insensitivity enhancement of TGF-β1siRNA/chitosan nanoparticle modification and CRC liver metastases in mice; the effect of TGF-β1siRNA on the key proteins expression of MAPK signaling pathway in tumor microenvironment in mice liver and on function of macrophages, to explore mechanism of TGF-β1 inhibiting function of macrophages in tumor microenvironment in vivo and in vitro. The role of TGF-β1 inhibiting function of macrophages will also be confirmed in clinical samples of CRC liver metastasis and the clinical significance of the key proteins of MAPK signaling pathway will also be determined. We will uncover a new mechanism of TGF-β1 involved in CRC liver metastases.

在前期发现TGF-β1能抑制肿瘤细胞分化（Cancer Sci, 2010）及IL-12/壳聚糖纳米球靶向抑制小鼠CRC肝转移（Biomaterials, 2012）的基础上，我们提出构建TGF-β1siRNA/壳聚糖纳米载药系统靶向干预肝内转移瘤微环境的构想。预实验结果显示，TGF-β1siRNA/壳聚糖纳米球能通过改变肝内MAPK信号通路Ras、ERK等关键蛋白的表达抑制CRC肝转移。本研究将围绕TGF-β1siRNA/壳聚糖纳米球肝靶向性修饰、pH敏感性修饰与小鼠CRC肝转移之间的关系，及TGF-β1siRNA对小鼠肝转移瘤微环境MAPK信号通路关键蛋白的影响及对巨噬细胞免疫功能的影响，从体内外两方面实验明确TGF-β1在肿瘤微环境中抑制巨噬细胞功能的作用机制，并在CRC肝转移临床标本中验证Ras、ERK等关键蛋白的生物学意义，从而阐明TGF-β1调控CRC肝转移的新机制。

目的: 探讨壳聚糖（CS）作为TGF-β1的药物载体在结直肠癌（CRC）肝转移中的作用及其机制的研究。方法：（1）用不同序列的TGF-β1-siRNA处理小鼠结直肠癌细胞株CT26，Western blot筛选沉默效果最佳的TGF-β1-siRNA序列。（2）将三聚磷酸钠（tripolyphosphate，TPP）与CS通过离子凝胶法交联成空白纳米粒，探讨配制成分的改变对其理化性质的影响。（3）将TGF-β1-siRNA与CS/TPP结合，尾静脉注射入小鼠体内验证其肝靶向性及探讨TPP对CS的修饰作用对肝靶向性的影响。（4）用不同PH值的冰醋酸溶液溶解CS，配置CS/TPP/siRNA纳米粒悬液，探讨对siRNA包裹率的影响。（5）将筛选的CS/TPP/siRNA纳米粒悬液经尾静脉注射进CRC肝转移模型小鼠体内，探讨其对CRC肝转移的影响及作用机制。（6）将TGF-β1siRNA体外瞬转到CT26细胞株内，分析TGF-β1相关miRNAs的表达图谱，（7）将筛选出的miRNA的成熟体(mimics, M)体外瞬转到CT26细胞中，检测转染后CT26细胞的体外增殖和迁移能力的改变。（8）将CT26细胞皮下接种到裸鼠用于体内实验，瘤内注射CS/TPP/M的纳米粒悬液。(9)生物信息技术预测靶基因，并对其进行筛选和验证。结果：(1) TGF-β1-1998 siRNA在CT26细胞中的基因沉默效果最好。（2）CS/TPP纳米粒的粒径和Zeta电位主要随着CS浓度的改变而改变。（3）TPP修饰后250nm粒径的CS/TPP纳米粒有良好的肝脏靶向性，在PH6.8环境中纳米粒的释放率最高。（4）接受CS/TPP/siRNA尾静脉注射后，比单纯的CS/TPP和siRNA组注射肿瘤抑制效果更好。（5）TGF-β1-siRNA处理的CT26细胞株中6个miRNA过表达。(6) miR-493-5p-M著增加了miR-493-5p的表达; 经M转染的CT26细胞体外增殖能力和迁移能力下降。(7) 经CS/TPP/M瘤内注射后的体内实验结果显示，M组的肿瘤体积减小。（8）miR-493-5p的候选靶基因有四个，其中Srpk2和 Pumilio2 是miR-493-5p的有效靶基因。结论： CS/TPP/TGF-β1siRNA纳米粒能有效抑制CT26细胞的体内肝转移。