TGF-β1 相关差异性miRNAs在横纹肌肉瘤分化抑制中的调控机制

横纹肌肉瘤（RMS）低分化类型多见，但其分化阻滞的分子机制仍不详。在本课题组前期发现TGF-β1信号转导通过抑制肌转录因子MyoD下调肌分化相关基因表达的基础上，结合国外关于成肌细胞体外分化过程中MyoD促进肌特异性miRNA表达的研究结果，我们推测RMS中肌特异性miRNA的低表达与TGF-β1介导的MyoD功能抑制密切相关。预实验结果也显示抑制TGF-β1表达能明显促进RMS细胞中MyoD与肌特异性miR-206的结合。本研究在已建立的TGF-β1siRNA表达载体稳转细胞株基础上，采用miRNAs基因芯片、生物信息学、RIP及荧光素酶报告系统等技术，拟阐明TGF-β1相关差异性miRNAs在RMS分化阻滞中的作用，拟证实MyoD在TGF-β1信号转导与miRNAs调控靶基因中的桥梁作用，明确RMS分化阻滞的分子调控网络，为进一步开发针对调控网络中关键分子的靶点药物奠定理论基础。

本研究探讨TGF-β1信号通路与相关差异性microRNAs在人横纹肌肉瘤(RMS)肌分化调控中的作用。方法：(1) 用TGF-β1-siRNA处理RMS细胞株RD, SMS-CTR和RH28细胞，利用miRNA芯片聚类分析RMS细胞株中TGF-β1相关miRNAs的表达图谱。并用免疫组织化学（IHC）、RT-PCR、Western blot和Northern blot在RMS组织中验证。(2) 将筛选出的miRNA (miR-450b-5p)-成熟体(mimics, M)或抑制子(inhibitors, I)转染RD细胞和RH28细胞，采用RT-PCR法检测miR-450b-5p的表达。采用3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)渗入法和MTT法检测转染后细胞的增殖情况。采用疫荧光染色法检测转染后RD细胞的Caspase-3和TUNEL，观察细胞凋亡情况。(3) 将RD细胞接种到裸鼠用于体内实验，瘤内注射M或I后，采用体积测量初步估计M或I对致瘤性的影响。采用IHC对M处理的皮下RD组织染色检测其Ki67、肌形成蛋白、肌球蛋白和结蛋白表达。(4) 通过Target Scan6.1, Diana microT 4.0和MICRORNA.ORG生物信息软件筛选出miR-450b-5p的靶点。用靶点的野生型 /突变型-报告基因(Wt.UTR /Mut.UTR)和M /I共转染RD细胞，采用荧光素酶检测miR-450b-5p的功能性靶点. (5)用TGF-β1-siRNA, Smad4-siRNA, Smad2-siRNA和Smad3-siRNA转染RD细胞，同时结合外源性TGF-β1处理，采用RT-PCR检测miR-450b-5p表达水平。首次发现：(1) miRNA芯片结果显示，TGF-β1-siRNA处理的RMS细胞株中miR-4275, miRNA-4298, miR-411, miR-493* and miR-450b-5p表达增高，只有miR-2113的表达显著下调；IHC和RT-PCR检测发现TGF-β1低表达的RMS组织中miR-450b-5p的高过表达最为显著，并通过Western blot、Northern blot和RT-PCR得到验证。(2) RT-PCR结果显示，合成的miR-450b-5p类似物(Mimics, M)显著增加了miR-450b-5p的