化脓隐秘杆菌三种主要毒力因子协同功能解析

Arcanobacterium pyogenes (A.pyogenes) is a pleomorphic, no movement Gram-positive bacteria, which is very important conditional pathogen in ruminants and pigs. Our preliminary results indicated that A.pyogenes was an important pathogen of goat respiratory disease. The major virulence factors are hemolysin pyoysin (PLO), collagen-binding protein (collagen-binding protein, CbpA), and neuraminidase (neuraminidases, Nan), which played an important role in bacterial adhesion, invasion and colonization. At present, each function of major virulence factors has been reported comprehensively, but synergistic secretory mechanisms and pathogenesis of A.pyogenes have not been reported. In his study, the allelic exchange will be used to construct virulence gene deletion mutant of goat A.pyogenes, synergistic secretory mechanisms will be analyzed to reveal the synergistic function of several virulence factors, in order to provide the basis of synergistic function of related virulence factors of A.pyogenes, and mechanisms of molecular pathogenesis of goat A.pyogenes.

化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes, A.pyogenes)是一种多形性、无运动性的革兰氏阳性杆菌，是一种对反刍家畜和猪非常重要的条件性致病菌。化脓隐秘杆菌具有多个毒力因子，其中溶血素pyoysin(PLO)、胶原结合蛋白（collagen-binding protein，CbpA）、神经氨酸酶（neuraminidases，Nan)等为其主要的毒力因子，在细菌粘附、入侵和定植等过程中发挥着重要的作用。对于各毒力因子的功能研究比较全面，但对于各个毒力因子的协同分泌机制及其致病性相关研究还未见报道。本研究拟用同源交换(allelic exchange)技术，构建山羊化脓隐秘杆菌的毒力基因缺失突变株，分析各毒力因子间的相互协同分泌机制，揭示各毒力因子的协同致病作用， 为山羊化脓隐秘杆菌相关毒力因子效应性及协同性研究提供数据，并为山羊化脓隐秘杆菌分子致病机制奠定基础。

化脓隐秘杆菌是一种对羊非常重要的条件性致病菌。近年来，在三峡库区一直散发流行，造成了较大的经济损失。但是当前还未见对羊化脓隐秘杆菌的致病机理的研究。在此项研究中我们采用分离培养、PCR、全基因组测序、原核表达、同源重组、免疫印迹和差异蛋白组学等方法对山羊化脓隐秘杆菌在羊中的自然感染情况，毒力基因的分布，强毒株与弱毒株之间的差异蛋白和致病机理进行研究，获得了如下结果：.（1）在山羊自然感染病例中，化脓隐秘杆菌常引起淋巴结炎和淋巴结脂肪病变，对采集的134份山羊淋巴结炎样本进行PCR检测，发现化脓隐秘杆菌的感染率为3.75%。.（2）通过PCR检测发现，在重庆地区分离羊化脓隐秘杆菌都具有PLO，CbpA, NanH和NanP毒力基因，与Rzewuska M（2012）报道CbpA仅存在于12.0％的菌株中，NanP只存在于64.2％的菌株中有明显不同。.（3）对重庆分离的强毒株（WS株），进行了全基因组测序，在基因组序列中发现了调节生物膜形成的基因 LuxS。.（4）通过原核表达、免疫印迹等方法发现NRB和B1区域为化脓隐秘杆菌CbpA的肝素结合结构域，该区域为感染发生的关键功能区域。.（5）通过TMT技术对强毒株（WS株）与弱毒株（HB株、DZ株）进行定量蛋白组学分析，发现强毒株与弱毒株在核糖体遗传信息处理、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、肌醇磷酸盐代谢功能、氨基酸的生物合成功能均存在极显著的差异（p <0.01）；而在弱毒组中（HB株vs DZ株）与这些功能相关的蛋白差异不显著。.同时我们还发现在，虽然通过PCR扩增从3株菌种都能得到PLO, CbpA, NanH和NanP的基因，但是通过质谱检测在菌体内均只检测到神经氨酸酶NanP 蛋白，且相互间差异不显著。