化脓隐秘杆菌毒力基因nanH和nanP检测及与β-内酰胺类抗生素耐药相关性分析

Arcanobacterium pyogenes is a commensal on the mucous membranes of the upper respiratory and urogenital tracts of cattle, sheep, swine and other domestic animals, and it is often the cause of diseases such as metritis, mastitis, liver abscessation and pneumonia. As an opportunistic pathogen in economic livestock, it is crucial to investigate the expressions of virulence factors during the establishment of endometritis, and it is of importance to study the correlation between antibiotics resistance and virulence expression in preventing the emergence of bacteria with resistance and virulence factor. In this study, the MICs of Arcanobacterium pyogenes isolated from dairy cows with endometritis, against beta-lactam antibiotics were measured by disk diffusion in Mueller-Hinton agar to investigate its antibiotics resistant spectrum. The virulence factors nanH and nanP was amplified by PCR to analyse homology of gene. The fluorescent quantitative PCR was selected to investigate the expressions of nanH and nanP mRNA in Arcanobacterium pyogenes at different antibiotics resistant levels, which is aimed to study on the correlation between antibiotics resistance and two virulence factors, nanH and nanP, in Arcanobacterium pyogenes.

化脓隐秘杆菌是位于动物黏膜表面的一种革兰氏阳性菌，常引起多种动物如牛、羊、猪等动物多种器官的化脓性感染。化脓隐秘杆菌毒力基因的表达是研究其致病机制的关键，分析化脓隐秘杆菌的耐药表型与毒力基因之间的相关性，对化脓隐秘杆菌耐药机制的研究具有重要意义。本研究从患有临床型奶牛子宫内膜炎的奶牛分离得到化脓隐秘杆菌，采用琼脂平板法测定化脓隐秘杆菌对12种β-内酰胺类抗生素的MIC值，分析化脓隐秘杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐药表型；并对化脓隐秘杆菌的毒力基因nanP和nanH进行克隆，分析其基因及编码氨基酸同源性；并通过荧光定量PCR的方法测定不同耐药表型的化脓隐秘杆菌毒力基因nanP和nanH mRNA的表达量的差异，以检测化脓隐秘杆菌耐药表型与毒力基因nanP和nanH之间的相关性。

化脓隐秘杆菌是一种革兰氏阳性条件致病菌，可引起多种动物的化脓性疾病，如子宫内膜炎、乳房炎、肝脓肿及肺炎等。化脓隐秘杆菌携带的多种毒力因子（plo、nanH、nanP、cbpA等）是其产生致病性的关键因素，分析化脓隐秘杆菌的耐药表型与毒力基因之间的相关性，对研究化脓隐秘杆菌耐药机制具有重要意义。本研究通过检测奶牛子宫内膜炎化脓隐秘杆菌毒力基因nanH和nanP的分布、变异及表达情况，分析毒力基因nanH和nanP变化与β-内酰胺类抗生素耐药表型之间的关系，为深入研究化脓隐秘杆菌耐药对致病力的影响，及对临床有效治疗化脓隐秘杆菌感染奠定了理论基础。.本试验应用PCR技术，检测34株奶牛子宫内膜炎化脓隐秘杆菌的毒力基因nanH和nanP，分析毒力基因的分布情况；并对β-内酰胺类抗生素不同耐药水平的部分菌株nanH和nanP基因进行测序，分析毒力基因氨基酸序列变异与耐药表型之间的关系。结果显示，34株分离株毒力基因nanH和nanP检出率分别为100%和97.06%。氨基酸序列分析表明，青霉素、苯唑西林耐药可能引起化脓隐秘杆菌NanH发生13个位点突变。苯唑西林高水平耐药可能引起NanH发生7个位点突变。头孢氨苄、头孢拉定低水平耐药可能引起化脓隐秘杆菌NanH发生26个位点突变。同时，青霉素、苯唑西林耐药可能引起化脓隐秘杆菌NanP发生6个位点突变。苯唑西林高水平耐药可能引起NanP发生15个位点突变。头孢氨苄、头孢拉定低水平耐药可能引起化脓隐秘杆菌NanP发生17个位点突变。.为定量分析化脓隐秘杆菌毒力基因nanH和nanP与耐药的关系，利用实时荧光定量PCR技术测定不同耐药水平菌株nanH和nanP基因mRNA的表达水平。结果表明，随β-内酰胺类药物耐药表型的增加nanH基因mRNA的表达水平呈降低趋势。而nanP基因mRNA的表达水平与标准菌株19411相比，变化不明显。.本研究成功克隆了化脓隐秘杆菌的毒力基因nanH和nanP，并分析了毒力基因nanH和nanP的分布情况及NanH和NanP氨基酸序列变异与β-内酰胺类药物耐药表型的相关性；在此基础上优化了化脓隐秘杆菌nanH和nanP基因表达量的实时荧光定量PCR测定方法，为深入探讨化脓隐秘杆菌耐药性的获得对其致病力的影响奠定了理论基础。