磺胺类药物受体蛋白DHPS的制备、分子识别机制研究及生物分析的建立

The specific recognition macromolecule is the key material and main bottleneck to develop the bioanalysis for multi-analyte. Receptor protein is the inherently and potentially promising broad-specific recognition materials to resolve the bottleneck. In the project we proposed, we try to clone, express and purify the wild type receptor protein dihydrofolic acid synthetase (DHPS) of sulfonamides, and to investigate the molecular recognition mechanism of wild type DHPS binding to sulfonamides by using enzyme assay,fluorescence spectral analysis, isothermal titration calorimetry and homology modeling,docking and quantitative structure - activity relationship (QSAR). The structural information about the binding site and the force type，distribution between DHPS and sulfonamides obtained by these techniques will be used to instruct the mutation and evolution of wild type DHPS. The DHPS mutant in term of improved affinity and selectivity is expected to obtain. The structure of competitive hapten also plays an important role in the bioanalysis for sulfonamides. The rational competitive hapten of sulfonamides based on quantitative information will be employed assisting by molecular connectivity indices (MCI) and hierarchical cluster analysis（HCA）. The bioanaysis based on DHPS mutant and designed competitive hapten for multi-sulfonamides detection in enzyme assay and fluorescence polarization assay format will be finally developed. The project present novel strategy, method and should be useful and significant to the advance of key materials and detection techniques of multi-sulfonamides.

广谱识别性大分子是建立多组分生物分析的关键物质，也是制约其发展的主要瓶颈之一。受体蛋白是一种天然的广谱识别性大分子，是解决此瓶颈的重要突破口。本项目以磺胺类药物受体蛋白二氢叶酸合成酶（DHPS）为研究对象，应用基因工程技术，从磺胺类药物敏感菌株中克隆、表达出天然的重组DHPS，应用酶分析、光谱分析、等温微量热测定等实验技术和同源模拟、分子对接、定量构效关系等分子模拟技术确定DHPS与磺胺类药物相互作用的氨基酸位点和力场类型及分布，阐明其分子识别机制，从而指导DHPS的定向突变、进化，筛选出对磺胺类药物具有更高亲和力的DHPS突变体。同时，应用分子连接性指数、层序聚类分析等定量方法，解析分子结构，开展竞争半抗原合理设计研究，最终建立基于DHPS突变体的磺胺类药物多残留生物分析技术。本项目为制备磺胺类药物广谱识别性物质和建立快速检测技术提供了新的研究思路和技术方法，具有重要的理论意义和应用价值

广谱识别性材料是建立多组分生物分析的关键，也是制约其发展的主要瓶颈之一。受体蛋白作为一种天然的广谱识别性大分子，是解决此瓶颈的重要突破口。本项目筛选出了对磺胺类药物敏感的肺炎链球菌R6和大肠杆菌ATCC 25922菌株，体外克隆并表达了二氢蝶酸合成酶，其大小分别为34 KDa和30 KDa。通过表面等离子体共振试验，酶标记、荧光偏振分析，发现该蛋白可广谱识别29种磺胺类药物，其平衡解离常数为0.15-5.82 μM；分子对接可知氢键和疏水作用力是该受体与磺胺配体相互作用的关键。基于二维结构及三维定量构效关系模型，设计合成了磺胺类药物新型半抗原hapten-1和CS。将蛋白进行虚拟氨基酸突变，基于所得结果，分别对235位丝氨酸和284位组氨酸进行单点突变，得到突变体2株，表达获得蛋白DHPS-S235R和DHPS-H284K。通过酶分析，发现突变蛋白与天然蛋白对磺胺类药物的亲和力基本一致。建立了动物源性食品中，包括牛奶、鸡肉、猪肉、鸡蛋、蜂蜜等的磺胺类药物多残留快速检测方法，方法的灵敏度达到了国家对磺胺类药物的残留限量的要求。本项目通过制备二氢蝶酸合成酶和合理设计半抗原，解决了目前存在的磺胺类药物抗体其广谱识别性不足和快速检测磺胺种类不多的难题，为兽药残留快速检测领域提供了新的研究方法和研究思路，具有较为重要的理论意义和应用价值。本项目共计培养7名研究生，发表13篇SCI文章（其中第一标注12篇），申报国家发明专利4项。项目负责人获2016年国家自然科学优秀青年基金，部分研究内容获2015年国家技术发明奖二等奖。