小分子化合物夹心免疫分析法中靶标物分子尺度极限的确定与验证研究

Veterinary drugs, pesticides and mycotoxins are small molecule compounds whose molecular weight usually are below 1000 Da. Those compounds only have one epitope and are mostly detected by using competitive format. Comparing with competitive immunoassay, sandwich immunoassay provides many advantages in term of sensitivity, specificity and stability. However, the molecular limit of small molecule compound is unknown which could be used in sandwich immunoassay. In this project, we prepared a set of melamine-nitroaniline compounds used as reference molecules and the molecular parameters of those compounds are calculated by computational chemistry. After producing many monoclonal antibodies to melamine and nitroaniline, respectively, and sandwich immunoassays will be developed for those melamine-nitroaniline compounds and then the limit of molecular scale of compounds which could be used in sandwich immunoassay will be determined and the best molecular parameter will also be selected to describe the molecular scale. The gene of capture and detecting antibody variable region will be obtained by using gene engineering and three-dimensional model of antibody will be constructed. The recognition mechanism of antibody will be explained by mean of docking antibody to the smallest melamine-nitroaniline compounds. Finally, haptens of flocoumafen and ivermectin will be designed and synthesized, and then monoclonal antibodies will be generated. The sandwich immunoassay will be developed for flocoumafen and ivermectin and then applied to food samples. The project will provide theoretical basis for developing sandwich immunoassay for the detection of small molecule compounds.

兽药、农药和霉菌毒素等小分子化合物的分子量均低于1000 Da，只含有一个抗原决定簇，在免疫分析中大多采用竞争法。与竞争法相比，夹心免疫分析法在灵敏度、特异性和稳定性方面具有明显优势。但夹心免疫法中靶标物分子尺度的极限尚未可知。本项目拟构建不同分子尺度的三聚氰胺-对硝基苯胺系列化合物，通过计算化学获得各种分子尺度参数；通过制备多种三聚氰胺和对硝基苯胺的单克隆抗体，建立针对不同尺度的三聚氰胺-对硝基苯胺化合物的夹心免疫分析法，从而确定夹心免疫分析法中靶标物的最小分子尺度以及描述分子尺度的最佳分子参数。采用基因工程技术获取抗体的可变区序列，构建三维结构并与最小分子尺度的化合物对接，阐明夹心免疫分析法中抗体的分子识别机制。最后设计合成氟鼠酮和阿维菌素的半抗原，分别制备单克隆抗体，建立夹心免疫分析法并应用于食品样本。本研究可为构建小分子化合物的夹心免疫分析法奠定理论基础和实践经验。

抗菌药物、非法添加物和霉菌毒素等小分子化合物的分子量（molecular weight，MW）通常低于1000 Da，只含有一个抗原表位，在免疫分析中大多采用竞争法。与竞争免疫分析法相比，夹心免疫分析法在灵敏度、特异性和稳定性方面具有明显优势。尽管有极少数研究报道了针对小分子化合物的夹心免疫分析法，但夹心免疫分析法中分析物的尺度极限尚未可知，限制了其在小分子化合物分析领域的应用。本项目以三聚氰胺（melamine，MEL）和对硝基苯胺（p-nitroaniline，NIA）为模式表位，设计并合成9种不同分子尺度的模式分析物MN1-MN9，同时设计合成不同间隔臂长度的6种MEL半抗原和6种NIA半抗原，经质谱和核磁共振鉴定合成成功。合成免疫原后免疫小鼠，制备得到多种识别特性各异的单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb），包括6株针对MEL表位的mAbs，IC50为16-79 ng/mL，以及10株针对NIA表位的mAbs，IC50为81-5,403 ng/mL。将制备得到的MEL和NIA mAbs进行两两配对组合，建立了1188种对MN1-MN9的夹心免疫分析法，确定了夹心免疫分析法中的极限分析物为MN1（MW=304 Da，表位距离为2.4 Å），是目前已报道的可用于夹心免疫分析的最小分子。使用表面等离子共振技术、分子对接和分子动力学，对夹心免疫分析法中分子识别机制进行了研究，发现分析物的表位距离<8.8 Å时，在抗体结合过程中会发生严重的空间位阻，降低了建立夹心免疫分析法的成功率。此外，由短间隔臂（2-4个碳原子）和长间隔臂（10-12个碳原子）半抗原诱导的mAbs结合口袋过浅或过深，均可能造成空间位阻，不利于夹心免疫分析的建立。最后，选择新的模式分析物SBA-NOR及典型真实分析物辣椒素和阿维菌素建立了夹心免疫分析法，对结论进行了进一步验证。本项目为构建小分子化合物的夹心免疫分析法奠定了理论基础和实践经验，具有重要的学术价值和应用前景。