靶向下调Bcl11A、SOX6及KLF1表达诱导β地中海贫血红细胞胎儿血红蛋白的作用及机制研究

β-thalassemia is one of the most common hereditary hemolytic diseases in Guangxi. Genetic therapy is a promising strategy for thalassemia. We have reported reducting a-globin synthesis and restoring a and non-a globin balance by using a small interfering RNA (siRNA)in β-thalassemic erythroid cells.We found the rs1427407 and rs766432 of BCL11A were associated with Hb F level in thalassemia patients. In this study,we plan to use an in vitro model of human erythropoiesis to assay for enhanced production of HbF after gene delivery into CD34 cells obtained from mobilized peripheral blood of normal adults or steady-state bone marrow from patients with β-thalassemia major. Lenti-viral vectors encoding a siRNA targeting the γ-globin gene repressor as BCL11A, SOX6 and KLF1 are tested. The mRNA of γ-globin and other globin(ζ,α,ε,δ,β) are assessed using the qPT-PCR method. The HbF, HbA and HbA2 levels are tested by high-performance liquid chromatography (HPLC). Western Blot analysis for BCL11A, SOX6 and KLF1 are done. The purpose of our study is to confirm the BCL11A, SOX6 and KLF1 as a therapeutic target for reactivation of HbF in Chinese β-thalassemia patients.

广西是地贫的高发区，重型β地贫临床缺乏有效的治疗手段，基因治疗已成为临床的希望。我们前期在体外利用小RNA干扰（siRNA）技术调控α珠蛋白基因的表达，能纠正β地贫病人红细胞α与非α珠蛋白链的合成不平衡,减少红细胞凋亡。我们还发现地贫患者BCL11A基因位点rs1427407，rs766432与HbF水平有关。本课题拟以β地贫病人的CD34+细胞为对象，采用siRNA及慢病毒载体基因转染技术，分别靶向下调Bcl11A、SOX6及KLF1的表达,运用定量PCR技术、高效液相技术观察其激活γ珠蛋白基因表达，诱导HbF合成的作用。此外，观察靶向下调Bcl11A、SOX6及KLF1的表达对β地贫病人红细胞其它珠蛋白基因（ζ、α、ε、δ、β）表达的影响；采用Western Blot技术观察Bcl11A、SOX6及KLF1之间的相互影响，探讨其作用机制，为临床靶向治疗β地贫提供实验基础。

背景：β地中海贫血是一种严重危害人类健康的遗传性溶血性疾病，临床研究发现，增加胎儿血红蛋白（ Fetal Hemoglobin， HbF）的合成能减轻β地中海贫血病人的临床表现。已有的研究表明，Bcl11A、SOX6、KLF1是调控HbF表达的相关转录因子，但是针对β-地中海贫血患者靶向调控SOX6、KLF1的表达诱导HbF合成治疗β地中海贫血的实验研究，国内外未见报道。针对中国常见的基因型β-地中海贫血患者，靶向调控Bcl11A的表达诱导HbF合成治疗β地中海贫血患者的实验研究，国内外未见报道。.方法：在K562细胞系和以正常人及广西常见基因型β地中海贫血病人单个核细胞为对象，在体外分化的红细胞中，运用慢病毒载体基因感染细胞，分别抑制Bcl11A、SOX6和KLF1的表达,采用实时荧光定量多聚酶链反应(Real time fluorescent quantitative Polymerase Chain Reaction， RT-PCR)，蛋白质免疫印迹方法（Western Blot）方法在信使核糖核酸（Messenger Ribonucleic Acid,mRNA)和蛋白层面观察其对人γ珠蛋白基因的调控作用。.结论： 1.分别下调BCL11A与SOX6的表达，在K562细胞系，正常人及β地中海贫血患者体外分化的红细胞中均可以上调γ珠蛋白基因表达，其中下调SOX6在β地贫患者体外分化的红细胞中观察到的γ珠蛋白基因表达的上调在国内外属首次报道。. 2.下调KLF1在K562细胞系里观察到γ珠蛋白基因表达的下降，提示KLF1对于γ珠蛋白基因表达可能有正向调节和负向调节的双重作用，具体的调节作用可能与KLF1作用的背景，协同因子和KLF1本身不同的修饰状态的有关，KLF1因子对γ珠蛋白基因表达调控的具体机制尚需进一步研究。下调KLF1在体外分化红细胞中虽然观察到γ/α mRNA比例升高，但是显著影响了红系的分化效率，故KLF1可能并不是一个理想的调控HbF合成的分子靶点。. 3.下调KLF1的表达，在K562细胞系和在正常人及β地中海贫血患者体外分化的红细胞中，均观察到KLF2表达的升高；提示KLF2有代偿KLF1的作用。在K562细胞系和在正常人及β地贫体外分化的红细胞中，揭示KLF2对KLF1的直接代偿作用在国内外属首次报道。