人红细胞内以血红蛋白为核心的抗氧化蛋白复合体组成及作用机制的研究

红细胞（RBC）暴露于广泛的氧化应激，抗氧化损伤对维持RBC的功能具有重要意义。超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和Peroxiredoxin2（Prx2）是RBC内主要的抗氧化酶。虽然这些酶均可消除过氧化氢或过氧化物，但在不同氧化应激中的作用机制尚未明确。我们的前期研究结果表明，血红蛋白（Hb）与Prx2之间存在相互作用。据此我们推测在不同氧化损伤条件下，RBC内的抗氧化酶是与Hb结合成复合体来发挥作用的。本研究拟将电泳释放和免疫共沉淀分别与双向电泳和质谱联用，首先捕获和检测不同氧化损伤条件下RBC内以Hb为核心的抗氧化蛋白复合体；然后利用Far Western、间接免疫荧光激光共聚焦及亲和毛细管电泳验证并检测蛋白间的相互作用及结合常数；最后用生物信息学方法构建复合体内蛋白质相互作用的模型，进而发掘不同氧化损伤过程中RBC内的生物标记分子，为RBC氧化损伤的检测提供理论依据。

红细胞(RBC)暴露于广泛的氧化应激，抗氧化损伤对维持RBC的结构与功能具有重要意义。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、硫氧还蛋白还原酶(TrxR)和硫氧还蛋白过氧化物酶(Prx2)等是RBC内主要的抗氧化酶。血红蛋白(Hemoglobin，Hb)既是RBC内活性氧产生的主要来源又是抗氧化酶保护的重要靶蛋白。本研究首先将免疫共沉降和Hb释放电泳分别与SDS-PAGE（或双向电泳）及质谱检测联用，捕获RBC内以Hb为核心的蛋白复合体，发现Hb可能与Prx2、CAT、Spectrin及Band3等蛋白间存在相互作用。然后我们利用免疫印迹证明Hb与Prx2及spectrin间存在相互作用；利用离散增量结合二次判别分析及STRING在线分析对已发现的可能的相互作用进行分析，结果显示，Prx2可能与HbA和HbF发生相互作用，但与HbA2不发生相互作用；STRING在线分析虽然没有发现Hb与抗氧化蛋白间的相互作用，但抗氧化蛋白间可能存在相互作用，如SOD与Prx、GPX、CAT及Trx间以及Prx2与GPX间均存在相互作用；动态光散射对RBC及溶血液的HbA及HbA2的粒径进行检测，结果发现红细胞HbA2的粒径明显大于溶血液HbA2，说明红细胞HbA2与其他蛋白间存在相互作用；微量热泳动检测HbA与Prx2及CAT间的结合常数分别为1.71±0.0963及1750±52.4。随后我们利用H2O2及不同气体（空气、氧气及氮气）保存RBC来制备RBC氧化损伤模型，并检测氧化损伤后RBC内丙二醛含量及Hb再释放的改变，结果表明，不同浓度过氧化氢处理RBC不同时间，均可导致Hb再释放增强，加入抗氧化剂褪黑素或维生素C可减轻氧化损伤，使Hb再释放减弱。免疫印迹检测发现，RBC及溶血液电泳释放的HbA中均含有Prx2和CAT，但溶血液电泳释放的HbA2中只有CAT无Prx2。过氧化氢处理RBC后，血影中抗氧化酶CAT/Prx2比值逐渐减少；胞浆蛋白及RBC电泳释放的HbA中CAT/Prx2比值增加；而RBC电泳释放的HbA2及再释放Hb中CAT/Prx2比值与对照相比没有显著性差异。本研究进一步明确了RBC内Hb复合体的组成及Hb与抗氧化蛋白间的相互作用，为深入理解RBC的抗氧化机制，发掘RBC氧化损伤过程中的生物标记分子奠定了理论基础。