GEF5及其可变剪切体调控肺腺癌侵袭转移的功能与机制研究

The invasion and metastasis of tumor cells is a major cause of poor prognosis and recurrence in lung adenocarcinoma patients. This process is primarily mediated by epithelial mesenchymal transition (EMT) accompanied with basement membrane degradation by matrix metalloproteineases, but the underlying mechanism remains obscure. Our previous studies have shown that the expression of GEF5-Vs, a GEF5 splice variant, is abnormally high in some of lung adenocarcinoma tissue samples and cell lines, and improve the invasion and metastasis of lung adenocarcinoma cell. Moreover, GEF5-Vs may promote lung adenocarcinoma invasion and metastasis by regulating EMT and MMP2 expression. In this study, the roles of GEF5 splice variants in lung adenocarcinoma invasion and metastasis are identified by clinical sample analysis and functional assays. Then the GEF5-regulated signaling pathways are studies by phosphoproteomics. Based on these data, the proposed functions of GEF5 in EMT induction and MMP2 expression are investigated, and the molecular mechanisms underlying the effects of GEF5 on lung adenocarcinoma invasion and metastasis will be clarified. These studies would expand our knowledge of GEF5 functions, revise our approaches for clinical diagnosis of lung adenocarcinoma, and may provide new therapeutic opportunities against such diseases.

肺腺癌患者术后不良和复发的根源来自癌细胞的侵袭转移。此过程主要由癌细胞通过上皮间质转换(EMT)来完成，并依赖基质金属蛋白酶(MMP)对基底膜的降解，其具体调控机制尚不清楚。我们的前期研究发现，GEF5可变剪切体(GEF5-Vs)在肺腺癌组织和细胞中异常升高，具有促进肺腺癌细胞侵袭转移的功能；且介导EMT的关键转录因子以及MMP2的表达。这些结果提示，GEF5-VS可能通过促MMP2表达和EMT介导肺腺癌侵袭转移。本项目拟结合临床样本检测和细胞功能实验，明确在肺腺癌侵袭转移中，GEF5的不同可变剪切体各自所具备的功能，并通过磷酸化蛋白组学技术手段分析它们分别所调控的信号通路。在此基础上，重点围绕靶信号介导GEF5对EMT及MMP2的调控作用，阐明GEF5及其可变剪切体调控肺腺癌侵袭转移的具体机制。研究有望为肺腺癌的临床诊疗提供理论依据和新的药物靶点，并拓展对GEF5分子功能的认识。

研究背景：非小细胞肺癌是最常见的肺癌类型。在过去的20年内，非小细胞肺癌的5年生存率仍然低于15%。目前缺乏特异并且精确的分子标记物来预言非小细胞肺癌患者的生存率，因此，寻找这类分子标记物显得具有重要意义。.研究目的：评估GEF5 (即ARHGEF5)在肺腺癌细胞中的恶性表型，计算机模拟设计拮抗肽。.实验设计：在NSCLC的II期患者中，肿瘤中GEF5高表达者无进展生存率较低。下调GEF5提高了肺腺癌耐药细胞株A549/DDP和H661细胞对顺铂的敏感性。此外，下调GEF5使A549/DDP细胞PIi3k/Akt/mTOR途径失活，并诱导自噬。自噬抑制剂3-MA显著逆转了下调GEF5后NSCLC细胞对顺铂的敏感性。此外，在裸鼠模型中，下调GEF5表达的NSCLC细胞对顺铂的敏感性上调。我们的研究表明，肿瘤中抑制GEF5的功能和自噬的靶向调节是顺铂耐药肺癌患者潜在的治疗策略。同时利用计算机建模：TIM蛋白是全长Rho鸟苷酸交换因子5(GEF5)的一个简短的异构体，它通过激活Rho家族的GTPases，作为Rho依赖性信号通路的功能调节者。我们用19个N取代氨基酸类型系统地替换了ssp肽核心49pxxp52基序中的两个关键脯氨酸残基pro49和pro52，得到了TIM SH3结构域的多种非天然肽类配体。 通过荧光光谱确认成功地设计了许多有效的胃蛋白酶，其中3个(即ssp [ n-ile49，n-asn52] ，ssp [ n-phe49，n-gln52]和ssp [ n-tyr49，n-asn52])相对于天然的ssp多肽(kd 0.09,0.07和0.04 m)显著提高了亲和力。.实验结论：GEF5活化与肺腺癌恶性进展有关。计算机模拟的拮抗肽配体，计算分析具有高亲和力。GEF5可能作为一个EMT进展的肺腺癌潜在的治疗目标。