PD-1LIg和CD40L胞外区基因共修饰的未成熟树突状细胞诱导恒河猴肝移植免疫耐受的实验研究

寻找诱导免疫耐受的新方法，是克服移植排斥反应的最佳途径。本课题拟研究 PD-1LIg和CD40L胞外区基因共修饰的未成熟树突状细胞诱导肝移植免疫耐受的作用和机制。首先构建CD40L胞外区和PD-L1Ig双基因修饰imDC，体外实验观察其对人外周血T细胞增殖的影响，建立恒河猴肝移植模型，体内实验研究双基因修饰imDC诱导免疫耐受的作用，研究T淋巴细胞无能、Th2型免疫应答偏移及CD4＋CD25+ Treg在双基因修饰imDC诱导免疫耐受中所起作用。在非人灵掌类动物水平探索诱导肝移植免疫耐受的新方法，在imDC诱导免疫耐受机制方面进行理论探索。PD-1LIg和CD40L胞外区基因共修饰的未成熟树突状细胞若能在非人灵掌类动物上诱导持久免疫耐受，将具有重要的理论意义及临床应用前景。

移植排斥反应仍然是制约肝移植疗效的主要原因。寻找诱导免疫耐受的新方法，是克服移植排斥反应的最佳途径。本课题拟研究 PD-1LIg和CD40L胞外区基因共修饰的未成熟树突状细胞诱导肝移植免疫耐受的作用和机制。本研究构建CD40L胞外区和PD-L1Ig双基因修饰未成熟树突状细胞，体外实验观察其对外周血T细胞增殖的影响，建立恒河猴肝移植模型，体内实验研究基因修饰未成熟树突状细胞诱导免疫耐受的作用。 .本课题研究取得以下成果：（1）成功构建了含CD40L胞外区基因的重组腺病毒载体pAd-CMV- efCD40L和表达PD-L1Ig融合蛋白的重组腺病毒。（2）成功培养诱导出恒河猴骨髓树突状细胞并进行了鉴定。从骨髓中筛选单个核细胞，免疫磁珠法从单个核细胞分离CD34+细胞并进行纯度鉴定，加入细胞因子培养诱导CD34+细胞向树突状细胞分化，培养出树突状细胞用流式细胞仪、电镜分别对表面标志、内部结构和外部形态进行鉴定证明树突状细胞分离培养成功。（3）证明转染表达CD40L胞外区基因腺病毒的树突状细胞能刺激T淋巴细胞增殖的能力下降。将表达CD40L胞外区基因腺病毒转染树突状细胞，PCR以及Western Blot鉴定CD40L在树突状细胞中的表达，混合淋巴细胞培养，使用CCK-8试剂盒检测不同处理组的树突状细胞对刺激T细胞增殖的能力。检测发现重组腺病毒感染未成熟树突状细胞处理组对刺激T细胞增殖的能力显著低于对照处理组。（4）证实感染CD40L胞外段基因表达腺病毒的树突状细胞能减轻恒河猴肝移植后急性排斥反应。采用双袖套法建立恒河猴肝移植模型，分为对照组、树突状细胞组和感染CD40L胞外段基因表达腺病毒的树突状细胞组，树突状细胞组和感染CD40L胞外段基因表达腺病毒分别通过门静脉输入1×106/kg树突状细胞和感染CD40L胞外段基因表达腺病毒的树突状细胞，观察发现感染CD40L胞外段基因表达腺病毒的树突状细胞组肝穿组织急性排斥反应病理评分低于对照组。但各组生存期及肝功指标无统计学差别。在非人灵长类动物水平探索诱导肝移植免疫耐受的新方法，我们的成果具有一定的理论意义及临床应用前景。