死骨片1蛋白经维生素D受体调控克罗恩病肠道纤维化的作用及分子机制研究

Crohn's disease (CD) is one of the chronic bowel diseases with high morbidity. Edema and fibrosis are the common reasons for obstruction, but the pathogenesis is poorly understood. Recent studies found that Sequestosome 1 (p62/SQSTM1)played an important role in stromal cells and could ameliorate intestinal fibrosis by binding to Vitamin D receptor(VDR). Our previous studies revealed that the expression levels of p62/SQSTM1 and VDR in the bowel specimen from CD patients with fibrosis significantly decreased. However, the pathogenic mechanism remains unknown. Using lentiviral vector construction, target gene knockout and knockin technology, this project is aimed to determine if p62/SQSTM1 is downregulated in CD, and its binding to VDR is weakened resulting in increasing extracellular matrix deposition and cell proliferation, which involves in the pathogenesis of CD fibrosis, and also to analyse the relation between p62/SQSTM1,VDR and the clinical pathological features of CD fibrosis. The findings of this project will possess high originality and clinical significance.

克罗恩病（CD）是高发慢性肠病，水肿与肠道纤维化增生是梗阻发生的常见原因，但CD肠道纤维化机制尚未明了。近年报道死骨片1（p62/SQSTM1）表达下调是导致器官纤维化的重要原因，并且其下游机制与调节维生素D受体（VDR）有关。我们前期研究发现，CD纤维化患者肠组织手术标本中，成纤维细胞p62/SQSTM1和VDR表达均显著下降，但p62/SQSTM1调节VDR并影响CD纤维化发生发展的分子机制尚不明确。本项目拟进一步确认p62/SQSTM1、VDR与CD纤维化临床病理特征关系，并建立CD纤维化细胞和小鼠模型，采用慢病毒载体构建、基因敲除、基因敲入等技术，在体内和体外阐明p62/SQSTM1是否通过VDR途径，调控TGF-β1/Smad和HIFs信号通路，引发细胞外基质沉积增加及细胞增殖，导致CD纤维化的发生发展。本研究有望揭示CD纤维化发生发展机制并为疾病防治提供新依据。

本课题旨在研究维生素受体（VDR）和p62/SQSTM1在克罗恩病（CD）并发症肠道纤维化中的作用及其机制。通过收集CD手术患者肠道标本、构建DSS和TNBS慢性肠炎小鼠模型、构建肠上皮VDR特异性敲除小鼠（VDR IEC-KO），我们发现肠道成纤维细胞功能性VDR或p62沉默能够通过促进纤维细胞活化和增加细胞外基质分泌介导的来促进肠道纤维化。此外，我们建立TGF-β1 诱导人肠上皮肿瘤细胞系 HT29的EMT 模型，通过分析和测量线粒体形态变化、体外细胞线粒体耗氧率 (OCR)、小鼠肠道上皮线粒体功能基因等，我们发现VDR 通过调节成纤维细胞活化和 EMT 来抑制肠纤维化。一方面，VDR 抑制 TGF-β/Smad 通路，阻止静止的成纤维细胞分化为肌成纤维细胞。 另一方面，VDR 通过维持线粒体的质量和数量来促进上皮完整性和屏障功能，从而减少炎症诱导的 EMT。免疫荧光共定位实验和免疫共沉淀实验证实VDR与p62有直接的蛋白-蛋白相互作用，两者相互促进，共同抑制纤维化的发生发展。进一步探究VDR与p62下游的信号通路，我们发现p62通过与CAV1相互作用通过自噬抑制肠道纤维细胞的活化。结论：VDR和p62在肠纤维化发生发展中具有的重要作用，且两者之间存在蛋白相互作用，并且这种作用与对肠道纤维细胞活化和细胞外基质分泌密切相关。VDR/EMT或CAV1/ p62/自噬途径可能是肠道纤维化治疗的潜在靶点。