vIL-10诱导同种异体组织工程化皮肤局部免疫耐受作用及机制的研究

种子细胞是组织工程的基本要素。目前，皮肤组织工程在种子细胞的研究方面主要存在：（1）种子细胞来源有限；（2）种子细胞的免疫异源性等关键问题，限制了其深入研究。本课题拟将vIL-10基因转染至成纤维细胞，构建含表皮与真皮的组织工程化皮肤，以其修复同种异体大鼠全层皮肤缺损，以证实vIL-10具有诱导移植的同种异体组织工程化皮肤免疫耐受的作用，延长移植物的存活时间，并对vIL-10诱导同种异体组织工程化皮肤免疫耐受的机制进行初步探讨。本研究的目的与意义在于为解决组织工程化皮肤种子细胞的来源问题提供新的方法，为大面积皮肤缺损的治疗开辟新的思路，为促进皮肤组织工程技术的临床应用奠定理论基础。若获得成功，将给皮肤移植及创面愈合领域带来突破性进展。

目的：探讨免疫调节因子vIL-10基因对修复同种异体大鼠全层皮肤缺损的免疫耐受作用，以期为解决皮肤移植领域的免疫排斥问题提供理论依据，为解决大面积皮肤缺损病人皮源不足问题奠定必要的基础。.方法：⑴PCR扩增原核载体PET-28a/vIL-10，获得目的基因vIL-10，PCR产物经纯化、EcoR I和Xho I双酶切后，连接到pcDNA3.1(+)载体上，构建真核重组表达载体pcDNA3.1(+)/vIL-10，经PCR、酶切及DNA测序分析确证；⑵用注射器冲洗法获取Wistar大鼠骨髓基质干细胞，经原代及传代培养后，以指数生长期的骨髓基质干细胞为研究对象，用Lipofectamine2000将pcDNA3.1(+)/vIL-10重组载体转染细胞（同时设立空载体为对照组），转染24h后，倒置显微镜下观察两组细胞的形态，转染48h后，RT-PCR检测目的基因的表达，SDS-PAGE电泳分析有无目蛋白的表达。稳定转染的细胞加入G418进行筛选，G418起始浓度100μg/ml，每周增加100μg/ml，终浓度为200μg/ml，两周后调整G418浓度为100μg/ml进行维持培养，收获细胞观察分析的内容同瞬时转染；⑶收集转染的骨髓基质干细胞（实验组）和未转染的骨髓基质干细胞（对照组），并在体外培养、扩增。.结果：⑴从原核载体成功扩增出目的基因510bp的vIL-10，与国际生物信息资源库GeneBank登录的EB病毒BCRF1段编码的基因片段相一致；⑵成功构建重组载体pcDNA3.1(+)/vIL-10，经PCR、双酶切、DNA测序鉴定正确；⑶重组载体pcDNA3.1(+)/vIL-10转染骨髓基质干细胞后，在瞬时和稳定转染的细胞中，显微镜下观察骨髓基质干细胞的形态变化，见细胞形态稍微有不规则，细胞碎片量增多，胞体向四周扩张成圆形或方形，突起减少，RT-PCR可检测到实验组510bp目的片段，SDS-PAGE电泳表明在蛋白分子量标准的97.2-20.1kD之间出现新的蛋白条带，目的蛋白出现在上清和细胞沉淀中，表明该细胞能够顺利表达vIL-10。.结论：⑴成功构建pcDNA3.1(+)/vIL-10重组载体；⑵将pcDNA3.1(+)/vIL-10重组载体成功转入骨髓基质干细胞。