甘遂、泽漆乳汁管的发育及不同发育时期乳汁的比较蛋白质组学研究

The laticifer is a specialized secretory structure in plant. At present, there are some different opinions about ultrastructural changes occurring during the differentiation of laticifers, and mechanism of autophagic phenomenon is not clear. Euphorbia kansui Liou and Euphorbia helioscopia L.are medicinial species of Euphorbia. laticifers are not only the major storage site of their medicinal component,terpenoid, but also contain rich proteins which take part in their development and synthesis of terpenoid. While, their protein composition has not been reported yet. The present study will describe the ontogeny,development process and the ultrstructural changes of nonarticulated laticifers in E. kansui and E. helioscopia on microscopic and ultramicroscopic level firstly; then, the protein composition in their latex at different developmental stages will be analysed comparatively by using proteomics techniques; and then, the distribution of characteristic latex proteins in laticifers at different developmental stages will be detected by using immune fluorescent marker technique; at last, subcellular localization of characteristic latex protein in laticifers at different developmental stages will be observed by using colloidal gold immunoelectron microscopy technique. Besides, the similarities and differences in protein composition and laticifer development will be analysed between two species in the same genus. Based on results above, the relation of ultrastructural changes with protein composition will be also discussed. The study will be benefit to understand the relation between autophagy phenomena of organelle and vacuole membrane and lysosome during the development of laticifers, and also provide theoretical basis for researching the biological synthesis mechanism and artificial regulation of bioactive compounds in laticifers.

乳汁管是植物的一种分泌结构，目前有关乳汁管发育超微结构变化仍存在分歧，且自噬现象的机理尚不清楚。甘遂、泽漆为大戟属药用植物，乳汁管是其主要药用成分萜类的集中贮存部位，其中含有丰富的蛋白质，它们参与乳汁管的发育、代谢产物的合成等，关于它们乳汁的蛋白质组成至今未见报道。本项目拟首先从显微和超微水平研究甘遂、泽漆无节乳汁管的发生发育以及在发生发育过程中的超微结构变化规律，在此基础上，利用蛋白质组学技术对其不同发育时期乳汁中蛋白质的组成进行分析，并利用免疫荧光技术确定特有乳汁蛋白在不同发育时期的乳汁管中的分布特点，再利用胶体金免疫电镜技术分析特有乳汁蛋白在乳汁管发育过程中的亚细胞定位，比较分析同属不同种植物乳汁管发育及蛋白质组成的异同，进而探讨其超微结构变化与蛋白质组分的相关性，为乳汁管发育中自噬现象机理的阐明提供科学依据，同时也可为乳汁管中生物活性物质的生物合成机理及调控研究提供理论基础。

以甘遂和泽漆为材料，利用蛋白质组学技术、基因克隆和抗体制备技术、免疫印迹技术、免疫组织化学技术及胶体金免疫电镜技术探讨乳汁管超微结构变化与蛋白质组分的相关性。结果表明：①甘遂和泽漆乳汁管发育过程中，线粒体、质体、微体等细胞器以选择性自噬的方式降解。②乳汁管中的蛋白组分复杂，它们参与了多种细胞代谢途径，调控着乳汁管的发育。我们在泽漆乳汁蛋白中发现了萜类合成MVA途径中的乙酰-乙酰辅酶A转移酶（AACT）（线粒体中）和甲羟戊酸二磷酸脱羧酶这两种关键酶。此外，我们还鉴定出了泛素，蛋白酶体亚基α型，蛋白酶体β型以及10个溶酶体蛋白，包括半胱氨酸蛋白酶、β-半乳糖苷酶、β-己糖胺酶、β-甘露糖苷酶、溶酶体α-甘露糖苷酶、磷脂酰胆碱固醇O-酰基转移酶、液泡ATP合成酶亚基h、液泡ATP合成酶亚基ac39、网格重链蛋白和AP-2复合物亚基β-1，这些蛋白可能与乳汁管发育后期细胞器和原生质中蛋白质的降解密切相关。③我们选择了泽漆萜类合成MVA途径中的乙酰-乙酰辅酶A转移酶（AACT）（线粒体中）和甲羟戊酸二磷酸脱羧酶这两种关键酶，以及溶酶体酶半胱氨酸蛋白酶和AP-2复合物4种蛋白进行了全长cDNA的克隆（EhAACT，注册号KP995935；EhMDC，注册号KP995936； EhCP，注册号KP995938 and EhAP-2B1，注册号KP995937），并获得了多克隆抗体，免疫印迹表明抗体可用于后续实验。④利用免疫组织化学技术观察到在泽漆乳汁管发育过程中，泛素蛋白和网格重链蛋白逐渐积累，在乳汁管成熟后消失。说明这两种蛋白在乳汁管的原生质体降解中起到非常重要的作用。⑤利用胶体金免疫金电镜技术观察到网格重链蛋白、半胱氨酸蛋白酶、AP-2复合物β亚基在乳汁管中主要分布于含有溶酶体酶的小泡、自噬体和自噬溶酶体中，说明这3种乳汁蛋白以形成含有溶酶体酶的小泡参与乳汁管细胞器的选择性自噬和原生质中蛋白质的降解。而泛素蛋白主要分布于细胞质中，参与原生质中蛋白质的降解。⑥我们对乙酰-乙酰辅酶A转移酶和甲羟戊酸二磷酸脱羧酶也进行了细胞免疫定位观察，发现它们也分布于乳汁管的原生质中，说明泽漆萜类骨架的合成是在细胞质中完成。