草地贪夜蛾中肠上皮细胞和sf9细胞Vip3A结合受体的鉴定

The binding of Bacillus thuringiensis insecticidal toxins to its receptors is belived to be a critical step for its potency. At present, aminopeptidase N, cadherin, alkaline phosphatase and glycolpids have been identified as receptors of insecticidal crystal proteins. The mechanism of how insecticidal crystal proteins interact with their receptors has been successfully implied to improve the potency and delay pest resistance. Vip3A is called as the second-generation insecticidal protein for its special mode action and broad-spectrum insecticidal activity. However, receptors of Vip3A are still unknown. In this research, we are going to identify the Vip3A receptor of sf9 cells and Spodoptera frugiperda midgut epithelial cells: 1) Screening and identification membrane protein bound to Vip3A via proteomics techniques; 2) Cloning, expression and purification the suspect receptors; 3) Identifying suspect receptors via ligand blot and Pull-down analysis in vitro; 4) as well as RNAi and laser scanning confocal microscope experiments in vivo. Significance and impact of the research is not only conducive to elucidate the insecticidal mechanism of Vip3A, but also help us to enhance its potency and delay pest resistance. Consequently, we can take full advantage of this excellent insecticidal protein.

苏云金芽孢杆菌( Bacillus thuringiensis , Bt)毒素与受体的结合是影响毒力的关键。目前，已知的Cry类蛋白受体主要有氨肽酶N，类钙粘蛋白、碱性磷酸酶和糖脂等。现已有成功利用受体与Cry类蛋白相互作用的机理来提高毒力，延缓抗性的报道。Vip3A因其独特的杀虫机理和广谱的杀虫活性而被誉为第二代杀虫蛋白, 但其受体尚不清楚。本项目拟采用对Vip3A敏感的草地贪夜蛾中肠上皮细胞和sf9细胞来筛选鉴定Vip3Aa的受体。包括: 1）应用蛋白质组学技术鉴定与Vip3A蛋白结合的细胞膜蛋白；2)克隆、表达纯化结合的膜蛋白 3）在体外应用配体印迹技术，Pull-down技术验证；4）在体内应用RNAi技术和激光共聚焦扫描显微镜技术鉴定筛选到的蛋白是否就是受体。本项目为揭示Vip3Aa的杀虫机理提供新的科学依据；同时在提高Bt毒力，延缓抗性方面有着极大的指导意义和应用价

苏云金芽胞杆菌分泌的营养期杀虫蛋白Vip3A被称为第二代杀虫蛋白，与杀虫晶体蛋白（Cry）没有同源性，杀虫机理也不相同。但Vip3A杀虫机理的研究要远远落后于Cry蛋白。迄今为止，还未见Vip3A确定受体的报道。.本项目研究通过应用流式细胞仪技术，DNA片段化分析等技术手段，首次证实Vip3A能够诱导sf9细胞发生凋亡，并且这种凋亡与线粒体膜电势的变化以及Caspase信号传导相关。在此基础上，我们开展了Vip3A受体的筛选鉴定研究。首先，采用亲和磁珠法，将钓取到的能与Vip3Aa结合的膜蛋白进行液相色谱-串联质谱分析（LC-MS/MS）。 质谱分析共检测到70种蛋白，包括29种核糖体蛋白(其中包括辛格等人发现的Vip3A的伴侣蛋白)和41种其他类型的蛋白（包括清道夫C型受体(Sf-SR-C)和成纤维细胞生长因子受体( FGFR) ）。由于Sf-SR-C和FGFR是膜蛋白，我们的研究重点也围绕它们展开。.1）体外实验（亲和磁珠钓取实验，免疫共沉淀实验和Pull-down实验）一致证实Sf-SR-C能与Vip3A结合；2）体内实验，我们发现Vip3Aa能够与sf9细胞的Sf-SR-C共定位，并且在果蝇S2细胞中异源表达的Sf-SR-C也能与Vip3Aa共定位；3）通过RNAi技术下调甜菜夜蛾的清道夫C型受体的表达后，Vip3A对这些幼虫的毒力明显下降；4）在果蝇幼虫中场中异源表达Sf-SR-C，转基因的果蝇幼虫变得对Vip3Aa敏感；5)进一步研究表明，Sf-SR-C胞外部分的CCP结构域和MAM 结构域与Vip3Aa的结合密切相关；6）通过4类9种特异性抑制剂的使用，我们显示Vip3A能通过一种依赖于发动蛋白、与巨胞饮相关的内吞方式进入胞内，并且通过荧光免疫方法和竞争结合的方法证实，Vip3A蛋白的这种内吞是Sf-SR-C激发的。.我们的结果首次揭示Sf-SR-C是Vip3A的特异受体，从分子水平解释了Vip3A杀虫特异性和作为生物杀虫剂的安全性。更重要的是，我们的结果显示Vip3A的杀虫机理与 Cry蛋白“穿孔”模型以及新提出的“坏死”模型不同，对Vip3A的理论研究和实际应用都会有显著地促进作用。.通过体内外实验，我们还发现FGFR也是Vip3A的受体。Sf-SR-C和FGFR这两类受体如何在杀虫过程中同时或者先后发挥作用，需要我们进行深入研究。.